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玉米赤霉烯酮对奶牛乳腺上皮细胞生长和乳脂合成相关基因表达的影响
1
作者 马梓峰 李巧 +8 位作者 徐红梅 李悦悦 殷实 何翃闳 熊燕 兰道亮 李键 熊显荣 付伟 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第1期201-210,共10页
旨在探索不同浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)生长和乳脂合成相关基因表达的影响。首先,用不同剂量ZEN处理MAC-T细胞36 h,血细胞计数板统计细胞数量,染色并分析细胞凋亡与坏死情况,筛选ZEN添加的合适剂量;接着,试剂盒检... 旨在探索不同浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)生长和乳脂合成相关基因表达的影响。首先,用不同剂量ZEN处理MAC-T细胞36 h,血细胞计数板统计细胞数量,染色并分析细胞凋亡与坏死情况,筛选ZEN添加的合适剂量;接着,试剂盒检测ZEN对MAC-T细胞中活性氧(ROS)以及线粒体膜电位的影响;最后,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,分析ZEN对MAC-T细胞增殖、凋亡、氧化应激和乳脂合成相关基因表达的影响。结果表明,低剂量ZEN(0.01~1.00μmol/L)有促进MAC-T生长的趋势,而高剂量ZEN(5.00~10.00μmol/L)显著降低MAC-T细胞数量;0.10μmol/L ZEN对MAC-T中ROS和线粒体数量无明显影响,但10.00μmol/L ZEN显著增加了MAC-T中ROS水平,降低了线粒体数量;RT-qPCR结果表明,0.10μmol/L ZEN显著促进增殖基因(CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4)和抗凋亡基因(BCL-2)表达,但同时提高了凋亡基因(CAS-3、BAX)表达量;10.00μmol/L ZEN显著抑制增殖基因(PCNA、CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4、AIFM2)和抗凋亡基因(BCL-2)表达,但显著促进凋亡基因(CAS-3、BAX)表达;值得注意的是,0.10μmol/L ZEN显著促进了乳脂合成相关基因(PPARγ、FASN、JAK-2),但10.00μmol/L ZEN显著抑制了这些基因表达。上述结果提示,不同浓度ZEN对MAC-T细胞的作用存在差异:0.10μmol/L ZEN可以促进MAC-T细胞生长和乳脂合成相关基因表达的同时,也会诱导凋亡基因表达;10.00μmol/L ZEN会诱导MAC-T细胞氧化应激、降低线粒体数量,抑制增殖、抗氧化、抗凋亡和乳脂合成相关基因表达,同时促进凋亡基因表达,导致细胞死亡。 展开更多
关键词 奶牛 玉米赤霉烯酮 乳腺上皮细胞 乳脂合成 增殖 凋亡
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A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
2
作者 秦文珍 李挺 +11 位作者 赵欣 董苏洁 翟焕杰 叶晨倩 叶曼青 童武 郑浩 于海 单同领 童光志 兰道亮 孔宁 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期195-200,共6页
A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重... A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒 VP1 原核表达 多克隆抗体
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牦牛六个多能性相关转录因子OSKMNL的克隆和多顺反子慢病毒载体的构建
3
作者 黄显朋 邢嘉仪 +4 位作者 白媛媛 姜雨婷 麻志伟 付伟 兰道亮 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1579-1591,共13页
旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克... 旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列,并对其进行生物信息学分析;应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;用293T细胞包装慢病毒,将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞,通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组,每个组设置3个重复)。结果表明,克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp;序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%;进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远;蛋白结构预测发现牦牛的6个转录因子OSKMNL都具有该基因家族相应蛋白功能的结构,比如POU结构域、HOX结构域、HMG结构域、Znf-C2H2结构域、HLH结构域、CSP结构域等;构建了慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;慢病毒感染293T细胞发现试验组表达红色和绿色荧光;慢病毒感染牦牛成纤维细胞发现试验组表达红色和绿色荧光,RT-PCR结果显示预期大小的条带。本研究成功克隆了牦牛的6个多能性相关转录因子OSKMNL;构建了分别携带牦牛3个转录因子的慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;包装的慢病毒能感染牦牛成纤维细胞。有利于推动多能性相关转录因子OSKMNL在牦牛干细胞中的应用,也为后续研究牦牛iPSC做准备。 展开更多
关键词 牦牛 基因克隆 序列分析 慢病毒载体
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胶原蛋白食用菌复配香肠工艺优化及贮藏过程中品质变化 被引量：1
4
作者 李一鸣 余娇 +5 位作者 石沁兰 李政阳 杨诗雨 兰道亮 王立娜 王琳琳 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第12期242-250,共9页
为了研究胶原蛋白及食用菌等原料的复配比例对牦牛肉灌肠产品品质的影响及其贮藏过程中的品质变化,并确定牦牛肉灌肠的最佳加工工艺。本研究以牦牛肉灌肠为试验对象,以牦牛蹄筋、香菇、食盐和黄酒等添加量为影响因素,在单因素实验基础之... 为了研究胶原蛋白及食用菌等原料的复配比例对牦牛肉灌肠产品品质的影响及其贮藏过程中的品质变化,并确定牦牛肉灌肠的最佳加工工艺。本研究以牦牛肉灌肠为试验对象,以牦牛蹄筋、香菇、食盐和黄酒等添加量为影响因素,在单因素实验基础之上,以感官评分为响应值,利用响应面法(Box-Behnken)进行四因素三水平的响应面分析试验,并建立二次多项回归模型。在此基础上进行牦牛肉香肠的贮藏试验,测定分析其在4℃条件下贮藏0、2、4、6、8、10 d食用品质和流变特性等指标变化。结果表明,胶原蛋白食用菌香肠的最佳工艺配方为香菇添加量10%、黄酒添加量2%、牦牛蹄筋添加量20%、食盐添加量2%,此时牦牛肉香肠的评分最高(78.23),品质最佳。贮藏试验结果表明,随着贮藏时间的延长,牦牛肉香肠的持水力(WHC)、pH、L^(*)值、a^(*)值、硬度、咀嚼性、回复性逐渐减小,b^(*)值、蒸煮损失随时间延长逐渐增大;内聚性、弹性变化不显著,流变特性变化显著(P<0.05)。由此可知,添加了胶原蛋白和食用菌经配方优化的牦牛肉灌肠在贮藏期间食用品质有一定的提升。 展开更多
关键词 牦牛肉灌肠 响应面优化 胶原蛋白 食用菌 贮藏品质
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GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位
5
作者 王甜 黄显朋 +4 位作者 朱洪阳 吉文汇 付伟 殷实 兰道亮 《西南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2023年第3期245-254,共10页
旨在探究GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达规律及亚细胞定位.通过卵母细胞体外培养技术、qPCR技术及免疫荧光技术测定GPR50在小鼠不同时期卵母细胞的转录水平及亚细胞定位.结果表明,所建立的qPCR方法敏感性高、特异性强、重复... 旨在探究GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达规律及亚细胞定位.通过卵母细胞体外培养技术、qPCR技术及免疫荧光技术测定GPR50在小鼠不同时期卵母细胞的转录水平及亚细胞定位.结果表明,所建立的qPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好且检测效率高,可用于测定GPR50在小鼠卵母细胞中转录水平的表达;GPR50在不同阶段小鼠卵母细胞中均有表达,生发泡破裂(GVBD)后,GPR50的表达量显著高于GV期(P<0.05);随着卵母细胞的发育,其表达量不断增高,到MII期达到顶峰,极显著高于GV、GVBD及MI期(P<0.01).随着卵母细胞的发育,GPR50大量表达于细胞质和细胞膜,但在成熟卵母细胞中,GPR50主要集中分布于细胞膜.以上结果说明,GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟中发挥重要的作用,为解析GPR50在哺乳动物卵母细胞体外成熟进程的分子机制奠定了基础. 展开更多
关键词 GPR50 小鼠卵母细胞 体外成熟 转录水平表达 亚细胞定位
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转录组测序及其在反刍动物中的应用研究进展
6
作者 杨玉霞 吉文汇 +1 位作者 付伟 兰道亮 《中国畜牧杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期75-81,共7页
近年来,随着下一代测序技术的快速发展和成本降低,转录组测序(RNA-seq)已经成为一种全面而准确的基因表达模式分析工具。反刍动物,尤其是牛羊等具备较高的经济价值,因此,研究反刍动物的转录组测序具有重要意义。本文介绍了RNA-seq技术... 近年来,随着下一代测序技术的快速发展和成本降低,转录组测序(RNA-seq)已经成为一种全面而准确的基因表达模式分析工具。反刍动物,尤其是牛羊等具备较高的经济价值,因此,研究反刍动物的转录组测序具有重要意义。本文介绍了RNA-seq技术及其在反刍动物应用中的最新研究进展,为反刍动物基因组学研究提供参考依据。 展开更多
关键词 转录组 RNA-SEQ 反刍动物 应用
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牛多能干细胞研究进展
7
作者 欧丹丹 吉文汇 +1 位作者 付伟 兰道亮 《中国草食动物科学》 CAS 2023年第2期47-54,共8页
多能干细胞(PSCs)是一类能够无限自我更新的细胞,能够分化成各种类型的组织,促进基因编辑和再生领域发展。牛作为最常见的家养有蹄类动物之一,具有很高的经济价值和遗传潜力,因此衍生稳定的牛多能干细胞对理解牛胚胎发育分子机制有着积... 多能干细胞(PSCs)是一类能够无限自我更新的细胞,能够分化成各种类型的组织,促进基因编辑和再生领域发展。牛作为最常见的家养有蹄类动物之一,具有很高的经济价值和遗传潜力,因此衍生稳定的牛多能干细胞对理解牛胚胎发育分子机制有着积极作用。目前,人们已在牛胚胎干细胞(bESCs)和诱导多能干细胞(biPSCs)方面做了诸多研究,但建立与小鼠和人类相当的bESC仍具有挑战性。文章重点综述了牛胚胎干细胞的各种衍生方式以及多能性维持的内部信号通路和外部微环境的相互作用,并介绍了诱导多能干细胞、扩展潜能干细胞的特点,以期为牛干细胞的相关领域提供参考。 展开更多
关键词 牛 多能干细胞 胚胎干细胞 诱导多能干细胞 扩展潜能干细胞
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牦牛发情期卵巢比较转录组学研究 被引量：8
8
作者 兰道亮 熊显荣 +3 位作者 柴志欣 艾鷖 黄偲 李键 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1830-1839,共10页
旨在进一步了解牦牛发情期卵巢的分子机制,解析牦牛繁殖的特殊性。本研究应用RNA-seq技术对牦牛和平原黄牛发情期卵巢进行转录组高通量测序及全基因组差异表达模式比对分析。通过比较分析牦牛和黄牛卵巢转录组数据,共筛选出1 307个差异... 旨在进一步了解牦牛发情期卵巢的分子机制,解析牦牛繁殖的特殊性。本研究应用RNA-seq技术对牦牛和平原黄牛发情期卵巢进行转录组高通量测序及全基因组差异表达模式比对分析。通过比较分析牦牛和黄牛卵巢转录组数据,共筛选出1 307个差异表达基因,其中661个基因表达量上调和646个基因表达量下调。进一步功能分析表明,这些差异基因涉及多种GO分类及KEGG通路。其中GO分类注释显示,差异基因与细胞粘附、激素调控等生物学过程存在密切关联,同时钙离子结合、阳离子跨膜转运等分子事件表现活跃。KEGG通路分析显示,补体和凝血级联通路的富集水平最高,其次为细胞色素P450相关通路。昼夜节律等一些新型通路,尽管与生殖功能没有明显关联,但也表现出显著富集。本研究首次对比牦牛和黄牛发情期卵巢转录组数据,筛选并分析相关差异基因。该研究结果为进一步阐述牦牛卵巢的基本分子机理提供基础,同时也为全面理解牦牛繁殖特异性提供新的思路。 展开更多
关键词 牦牛 发情期卵巢 转录组 比较分析 分子机制
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华东部分地区猪群中猪萨佩罗病毒分子流行病学调查 被引量：11
9
作者 兰道亮 吉文汇 +5 位作者 王长松 孙焕 陈莫林 崔立 童光志 华修国 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第12期116-121,共6页
为了解华东地区猪群中猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)感染流行情况,通过RT-PCR方法对该地区15个规模化养猪场960份猪粪便样本进行了检测。结果表明,所检测的15个养殖场均存在PSV感染,总体平均阳性率为17.2%,其中10周龄～20周龄... 为了解华东地区猪群中猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)感染流行情况,通过RT-PCR方法对该地区15个规模化养猪场960份猪粪便样本进行了检测。结果表明,所检测的15个养殖场均存在PSV感染,总体平均阳性率为17.2%,其中10周龄～20周龄的猪PSV最易感。进一步系统进化分析表明,所检阳性毒株同源性较高,不同地区的毒株交错分布在一起,不存在明显的地区差异,但大体可分为3个亚群,而且已有的国外PSV株均包括在这3个亚群中,这提示PSV可能至少存在3种不同的抗原亚型。 展开更多
关键词 猪萨佩罗病毒 分子流行病学 调查
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藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及系统进化分析 被引量：5
10
作者 兰道亮 王永 +2 位作者 张诚民 李键 汤承 《西南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第4期481-484,共4页
为解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群组成及其基本生物学特征,无菌采集12头健康藏绵羊新鲜粪便,分离培养及纯化乳酸菌株,并通过16S rDNA序列扩增和测序进行分子鉴定.结果显示:从12个样本中共分离纯化出19株乳酸单菌,分属于7个属,其中鹑鸡肠球菌... 为解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群组成及其基本生物学特征,无菌采集12头健康藏绵羊新鲜粪便,分离培养及纯化乳酸菌株,并通过16S rDNA序列扩增和测序进行分子鉴定.结果显示:从12个样本中共分离纯化出19株乳酸单菌,分属于7个属,其中鹑鸡肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌及植物乳杆菌所占分离比例较多.该结果为进一步了解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群种类及藏绵羊益生菌制剂的开发提供了基础. 展开更多
关键词 藏绵羊 乳酸菌 分离培养 16SrDNA
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基于微量RNA高通量测序技术的牦牛MⅡ期卵母细胞转录组研究 被引量：2
11
作者 兰道亮 熊显荣 +4 位作者 林宝山 陈亚冰 胡敏 苏小珊 李键 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期722-732,共11页
旨在现有高通量测序的基础上,建立一种针对牦牛卵母细胞等微量样本的RNA高通量测序方法,为进一步研究牦牛卵母细胞的转录组学提供基础。以微量MII期牦牛卵母细胞RNA(10ng)作为研究样本,应用SMART cDNA PCR扩增技术对样本进行富集并构建... 旨在现有高通量测序的基础上,建立一种针对牦牛卵母细胞等微量样本的RNA高通量测序方法,为进一步研究牦牛卵母细胞的转录组学提供基础。以微量MII期牦牛卵母细胞RNA(10ng)作为研究样本,应用SMART cDNA PCR扩增技术对样本进行富集并构建测序文库,再应用改进的RNA高通量测序技术对其进行高通量测序分析。经Illumina-Solexa深度测序后,得到了一个包含47 619 254条测序序列,4Gb大小数据量的微量MII期牦牛卵母细胞测序文库。质量控制(Quality control,QC)及基本结果分析表明测序文库质量良好。基因组比对分析显示,共有15 626个牦牛基因被映射。此外,还获得了7 348个新的转录本。GO分类注释结果显示,共有13 795个比对上的基因参与了生物过程、细胞组分及分子功能3大主要类别。进一步富集分析显示,分别有333 134及113个GO类别在上述3大类中得到富集。KEGG通路分析结果显示,共有13 496个比对上的基因参与了258条通路,其中101条通路得到有效富集。本研究以牦牛卵母细胞为样本成功建立了一种起始RNA量可低至10ng的微量转录组测序方法。该研究结果为进一步研究牦牛基因组提供了基础,同时也为研究牦牛MII期卵母细胞的分子机理提供了新的视角。 展开更多
关键词 牦牛 卵母细胞 MII期 转录组 微量 高通量测序
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GPR50生物学功能研究进展
12
作者 兰道亮 姚颖 +3 位作者 陈艳 熊显荣 吉文汇 李键 《西南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2021年第3期238-245,共8页
G蛋白偶联受体50(G protein-coupled receptor, GPR50)是属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)超级家族的一类跨膜蛋白,与Mel1c受体同源,介导跨膜转运和信号传递,在神经系统发育、能量代谢调节及糖皮质激素受体信号... G蛋白偶联受体50(G protein-coupled receptor, GPR50)是属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)超级家族的一类跨膜蛋白,与Mel1c受体同源,介导跨膜转运和信号传递,在神经系统发育、能量代谢调节及糖皮质激素受体信号等多种生理活动中发挥重要作用,同时也是阿尔茨海默病、肝癌等疾病的潜在生物学标志物,阐明GPR50的生理功能有助于为相关疾病治疗的进展、预后和发展提供可能方向.近年来,随着GPR50潜在作用不断被发现,其涉及的生理功能也不断被拓宽.详细介绍了GPR50的分子结构特征,总结了近年来GPR50的生物学功能研究进展,为GPR50的进一步研究提供参考. 展开更多
关键词 GPR50 跨膜蛋白 信号传递 生物标志物
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应用SMART cDNA合成技术富集鸡脾脏微量RNA
13
作者 兰道亮 岳华 汤承 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第3期6-9,共4页
以鸡脾脏中提取的20ng微量RNA为起始样本,应用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链及扩增第二链,并在原有基础上做了适当的优化和改进。同时与传统cDNA合成方法进行了比较。最终,从20ng总RNA中成功扩增出双链cDNA6.03μg,而采用传统方法... 以鸡脾脏中提取的20ng微量RNA为起始样本,应用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链及扩增第二链,并在原有基础上做了适当的优化和改进。同时与传统cDNA合成方法进行了比较。最终,从20ng总RNA中成功扩增出双链cDNA6.03μg,而采用传统方法只合成出0.03μg cDNA,且前者cDNA的质量和纯度明显高于后者。结果表明,通过SMART cDNA合成技术,可使鸡脾脏微量RNA得到有效地富集。 展开更多
关键词 SMART cDNA合成技术 脾脏 鸡
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牦牛TLR2和TLR4基因mRNA在不同组织中的表达分布研究 被引量：14
14
作者 林宝山 兰道亮 +3 位作者 黄偲 陈亚冰 黄勇 李键 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期901-903,共3页
为检测牦牛TLR2和TLR4基因m RNA在不同组织中的表达分布,本研究根据Gen Bank中牛TLR2和TLR4序列设计特异性引物,以β-actin为参照基因,建立了检测牦牛天然免疫受体TLRs家族TLR2和TLR4基因的荧光定量PCR方法,并对TLR2和TLR4基因在牦牛各... 为检测牦牛TLR2和TLR4基因m RNA在不同组织中的表达分布,本研究根据Gen Bank中牛TLR2和TLR4序列设计特异性引物,以β-actin为参照基因,建立了检测牦牛天然免疫受体TLRs家族TLR2和TLR4基因的荧光定量PCR方法,并对TLR2和TLR4基因在牦牛各组织中的表达分布进行了研究。结果表明,TLR2和TLR4基因在牦牛所有组织中均有表达,其中TLR2基因在小肠表达量最高,在卵巢表达量最低,在肾、肺、肝、心、脾、乳腺、大肠、肌肉等组织依次有较高的表达;TLR4基因在乳腺表达量最高,在肌肉表达量最低,在脾、肝、小肠、肾、卵巢、肺、心、大肠等组织依次有较高水平的表达。该研究结果提示TLR2和TLR4基因可能在牦牛抗病免疫分子机制中发挥重要的作用,对研究高原动物免疫机制和应对牦牛及其他高原动物重大疫病具有重要意义。 展开更多
关键词 牦牛 TLR2 TLR4 荧光定量PCR 组织表达分布
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SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用 被引量：15
15
作者 黄国君 岳华 +3 位作者 杨发龙 兰道亮 汤承 卢建远 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期450-454,共5页
根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR检测CDV核酸。以含有83bp扩增产物的pGM-T载体质粒为参考,构建了标准曲线。对该方法的特异性、敏感性、可重复性进... 根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR检测CDV核酸。以含有83bp扩增产物的pGM-T载体质粒为参考,构建了标准曲线。对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行了评价,与常规RT-PCR及胶体金免疫检测技术(GIA)进行了敏感性比较。结果表明,该方法能特异性检测到CDV的扩增信号;检测范围在5.2×102～5.2×108拷贝之间有良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为96.80%;敏感度高,最低检测限为52拷贝,比常规RT-PCR高103倍,比GIA高105倍;组内变异系数为0.51%～1.90%,组间变异系数为1.96%～2.63%。用建立的Real-time RT-PCR检测11例临床病例,CDV阳性率为100%。对犬瘟热弱毒活疫苗中的CDV进行定量,其含量在1.24×105～4.88×105拷贝/头份之间。该方法的建立为CDV的早期快速诊断、分子流行病学调查及疫苗质量监测等提供了一种新的快速定量检测手段。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR
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牦牛卵巢小RNA高通量测序及生物信息学分析 被引量：8
16
作者 熊显荣 兰道亮 +3 位作者 李键 字向东 林亚秋 马力 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期55-63,共9页
本研究旨在利用高通量测序技术描绘牦牛卵巢sRNA图谱,为探析牦牛繁殖性能提供基础。以牦牛卵巢组织作为研究对象,构建牦牛sRNA文库,进行高通量测序和生物信息学分析,最后利用RT-qPCR技术验证miRNA在牦牛卵巢组织中的表达。经测序后得到... 本研究旨在利用高通量测序技术描绘牦牛卵巢sRNA图谱,为探析牦牛繁殖性能提供基础。以牦牛卵巢组织作为研究对象,构建牦牛sRNA文库,进行高通量测序和生物信息学分析,最后利用RT-qPCR技术验证miRNA在牦牛卵巢组织中的表达。经测序后得到包含12 126 208条clean reads,其中特异序列为212 757条;比对分析显示,只有7 383 536(60.89%)条总序列及80 981(38.06%)条特异序列能与牦牛基因组匹配。与黄牛相比,牦牛sRNA中有56个表达量上调,其中miR-135a表达上调最显著;有33个表达下调,其中miR-2316表达下调最显著。RT-qPCR验证6个miRNA在牦牛卵巢组织中的表达情况,定量结果和测序结果基本一致。与牦牛EST序列信息比对后共预测出5个新miRNA。本研究成功绘制牦牛卵巢sRNA图谱,同时证实RNA-Seq高通量测序技术在完善sRNA信息及挖掘新miRNA方面的优势,对研究sRNA在牦牛遗传育种以及以牦牛为重要高原动物模型来进行高原适应性和抗逆性等相关领域的研究具有重要意义。 展开更多
关键词 牦牛 卵巢 高通量测序 小RNA 生物信息学
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麦洼牦牛TLR1～10基因克隆及分子生物学特征分析 被引量：6
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作者 林宝山 兰道亮 +4 位作者 陈亚冰 黄偲 符梅 李解 李键 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期728-737,共10页
本研究克隆了麦洼牦牛天然免疫受体1~10基因的编码区,利用生物信息学工具分析基因特点,荧光定量PCR测定TLRs基因在不同组织中的表达量。序列比较分析结果表明,麦洼牦牛TLR基因与其他物种在核苷酸水平及氨基酸水平上均表现出很高的保守... 本研究克隆了麦洼牦牛天然免疫受体1~10基因的编码区,利用生物信息学工具分析基因特点,荧光定量PCR测定TLRs基因在不同组织中的表达量。序列比较分析结果表明,麦洼牦牛TLR基因与其他物种在核苷酸水平及氨基酸水平上均表现出很高的保守性。遗传进化方面,麦洼牦牛TLRs与牛和绵羊TLRs遗传进化距离最近,并与人、马、鼠TLRs等形成哺乳动物的一个分支,与鸡则形成遗传距离较远的一个分支。同时我们在进行系统发育分析时发现,TLR1、TLR6先聚为一小支,再与TLR10又聚为更紧密的一支,然后TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分别聚集在两个单个的分支上,TLR其他成员各自成为一支。荧光定量结果表明,TLRs在麦洼牦牛各组织均有表达,但不同成员在不同组织的表达存在较大的差异。其中TLR2、TLR4和TLR6在脾表达量最高,在卵巢、小肠、肾、肝中有高表达,TLR1、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10在肾表达量最高,在肝、肾、脾等组织中高表达。综上所述,本研究的开展能为以后揭示TLRs在牦牛等高原模式动物分子免疫机制以及牦牛抗病育种奠定基础。 展开更多
关键词 麦洼牦牛 TLR1-10 克隆 荧光定量PCR 组织表达分布
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动物肠道乳酸菌的分离鉴定技术研究进展 被引量：15
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作者 梁彦彦 兰道亮 +3 位作者 林宝山 黄偲 陈亚冰 李键 《动物医学进展》 北大核心 2015年第10期90-94,共5页
乳酸菌是可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称,是对人和畜禽有益的益生菌。动物肠道中的乳酸菌耐受胃酸有更好的适应性,更易于在肠道中定植抵抗病原微生物的黏附,并且耐酸性好易于生存。论文综述了动物肠道乳酸菌分离培养的几种方... 乳酸菌是可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称,是对人和畜禽有益的益生菌。动物肠道中的乳酸菌耐受胃酸有更好的适应性,更易于在肠道中定植抵抗病原微生物的黏附,并且耐酸性好易于生存。论文综述了动物肠道乳酸菌分离培养的几种方法,总结出更适合分离乳酸菌的培养基。归纳了动物肠道乳酸菌的鉴定方法,包括形态鉴定、生化鉴定以及分子生物学的鉴定,重点介绍了16SrDNA的分子生物学鉴定方法。这对建立动物肠道中乳酸菌分离鉴定的方法,研究动物肠道中的微生物菌群组成有重要意义。 展开更多
关键词 动物肠道 乳酸菌 分离 鉴定
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牦牛TLR6基因的克隆、序列分析及其表达分布研究 被引量：6
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作者 林宝山 兰道亮 +4 位作者 黄偲 陈亚冰 张雁 王英 李键 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期91-97,103,共8页
为了解牦牛TLR6基因特点及其在牦牛各组织动态表达分布规律,根据GeneBank中野牦牛TLR6序列设计引物克隆并对所得序列进行生物信息学分析,建立荧光定量PCR方法,对TLR6基因在牦牛组织中的表达分布进行研究。基因序列分析表明,克隆得到牦牛... 为了解牦牛TLR6基因特点及其在牦牛各组织动态表达分布规律,根据GeneBank中野牦牛TLR6序列设计引物克隆并对所得序列进行生物信息学分析,建立荧光定量PCR方法,对TLR6基因在牦牛组织中的表达分布进行研究。基因序列分析表明,克隆得到牦牛TLR6基因编码区全长2 397 bp,编码氨基酸798个,N端含有26个氨基酸组成的信号肽,分子质量91.5719 ku,理论等电点6.45。蛋白预测结果表明,TLR6编码蛋白整体表现为疏水性。同源性分析表明,10条序列当中牦牛与野牦牛、普通牛、藏羚羊等物种具有较高同源性,在系统发育树中距离最近。该结果说明TLR6基因序列具有较高保守性。荧光定量结果表明,TLR6基因在牦牛所有组织中均有表达,TLR6基因在脾脏表达量最高,在肌肉表达量最低,在卵巢、肺、小肠、肝、肾、心等组织依次有较高表达。该结果可为进一步研究TLRs在牦牛等其他高原动物体内的分布及动态表达规律,以及牦牛抗病免疫及育种奠定基础。 展开更多
关键词 牦牛 TLR6 克隆 荧光定量PCR 组织表达分布
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NOBOX基因在麦洼牦牛卵母细胞、早期胚胎及胎儿卵巢的表达 被引量：5
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作者 符梅 陈亚冰 +2 位作者 李键 熊显荣 兰道亮 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1746-1751,共6页
旨在研究牦牛胚胎发育过程中NOBOX基因表达与卵母细胞、胚胎发育及胎儿卵巢的关系。利用RTPCR技术检测NOBOX基因在颗粒细胞、牦牛胎儿卵巢及牦牛各组织中的表达;并采用荧光定量PCR技术检测NOBOX基因在卵母细胞体外受精胚胎发育过程中(G... 旨在研究牦牛胚胎发育过程中NOBOX基因表达与卵母细胞、胚胎发育及胎儿卵巢的关系。利用RTPCR技术检测NOBOX基因在颗粒细胞、牦牛胎儿卵巢及牦牛各组织中的表达;并采用荧光定量PCR技术检测NOBOX基因在卵母细胞体外受精胚胎发育过程中(GV期、MII期、2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑椹胚和囊胚)的相对表达变化。结果表明,NOBOX基因在牦牛各组织中均有表达,其中肾表达量最高。在GV期卵泡中,NOBOX基因仅在卵母细胞中有表达,颗粒细胞中未检测到表达。早期胚胎发育过程中,随着胚胎发育,其表达量逐渐降低,在GV期时表达量最高(P<0.05),随后逐渐降低,在16-细胞表达量最低并趋于稳定。胎牛发育成长过程中,NOBOX基因在胎儿卵巢中表达量随着胎儿年龄的增长表达呈上升趋势。综上表明,NOBOX基因在牦牛早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在差异性,可能与早期胚胎的正常发育和不同的生理活动有关。 展开更多
关键词 牦牛 卵母细胞成熟 早期胚胎发育 胎儿卵巢 NOBOX基因表达
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