目的原核表达甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)衣壳蛋白VP1和VP3,并评价其免疫原性。方法PCR法扩增VP1和VP3基因片段,克隆至载体pET-G28a中,构建重组表达质粒pET-G28a-VP1和pET-G28a-VP3,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表...目的原核表达甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)衣壳蛋白VP1和VP3,并评价其免疫原性。方法PCR法扩增VP1和VP3基因片段,克隆至载体pET-G28a中,构建重组表达质粒pET-G28a-VP1和pET-G28a-VP3,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析表达产物。目的蛋白经离子交换层析纯化,复性后与多种佐剂配伍,免疫雄性BALB/c小鼠,随机分为VP1-MF59、VP1-AH、VP1-AP、VP1-AP-10CpG、VP1-AP-50CpG、VP3-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组,每组5只。ELISA法检测各组小鼠血清中IgG抗体效价,快速荧光灶免疫抑制试验测定VP1-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组小鼠血清中和抗体效价。结果菌落PCR及测序结果证明,重组表达质粒pETG28a-VP1及pET-G28a-VP3构建正确。重组蛋白VP1和VP3相对分子质量分别约为37000和26000,主要以包涵体形式存在,表达量分别为18.6%和32.4%,纯度分别为86.3%和84.7%,且分别可与兔抗HAV抗血清及鼠抗HAVVP3抗血清发生特异性结合。VP1-AP-50CpG组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP组(q=22.05,P<0.01),VP3-VP1-AP组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP及VP3-AP组(q分别为22.05和22.49,P均<0.01)。与PBS对照组比较,VP1-AP及VP3-VP1-AP组小鼠血清的中和抗体效价显著升高(q分别为7.79和25.11,P<0.01)。结论原核表达的HAV衣壳蛋白VP1和VP3纯度较高,且具有良好的免疫原性,制剂中添加CpG有利于增强抗原的免疫原性。本研究为HAV重组亚单位疫苗的研发奠定了基础。展开更多
目的在悬浮CHO-S细胞中稳定表达重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法应用RT-PCR技术从BALB/c乳鼠股骨组织扩增mbmp7基因,克隆至质粒pMD18-T,通过定点突变3个氨基酸编码序列(G266...目的在悬浮CHO-S细胞中稳定表达重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法应用RT-PCR技术从BALB/c乳鼠股骨组织扩增mbmp7基因,克隆至质粒pMD18-T,通过定点突变3个氨基酸编码序列(G266S、S287N、D359E),得到重组克隆质粒pMD18-mbmp7m3;将mbmp7m3克隆至表达载体pCHO1.0,构建重组表达质粒pCHO-mbmp7m3,转染CHO-S细胞,利用嘌呤霉素和甲氨蝶呤进行两轮加压筛选,有限稀释法筛选单克隆细胞,ELISA法检测rhBMP7成熟蛋白的表达。结果从乳鼠股骨组织扩增的cDNA经测序与GenBank中登录的序列完全一致,点突变后测序与设计完全一致。获得了稳定表达rhBMP7成熟蛋白的单克隆细胞株,最高表达量为202 ng/mL。结论成功利用改造的mbmp7基因在CHO-S细胞中表达了rhBMP7成熟蛋白,为后续该制品工艺开发及产业化奠定了基础。展开更多
文摘目的原核表达甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)衣壳蛋白VP1和VP3,并评价其免疫原性。方法PCR法扩增VP1和VP3基因片段,克隆至载体pET-G28a中,构建重组表达质粒pET-G28a-VP1和pET-G28a-VP3,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析表达产物。目的蛋白经离子交换层析纯化,复性后与多种佐剂配伍,免疫雄性BALB/c小鼠,随机分为VP1-MF59、VP1-AH、VP1-AP、VP1-AP-10CpG、VP1-AP-50CpG、VP3-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组,每组5只。ELISA法检测各组小鼠血清中IgG抗体效价,快速荧光灶免疫抑制试验测定VP1-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组小鼠血清中和抗体效价。结果菌落PCR及测序结果证明,重组表达质粒pETG28a-VP1及pET-G28a-VP3构建正确。重组蛋白VP1和VP3相对分子质量分别约为37000和26000,主要以包涵体形式存在,表达量分别为18.6%和32.4%,纯度分别为86.3%和84.7%,且分别可与兔抗HAV抗血清及鼠抗HAVVP3抗血清发生特异性结合。VP1-AP-50CpG组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP组(q=22.05,P<0.01),VP3-VP1-AP组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP及VP3-AP组(q分别为22.05和22.49,P均<0.01)。与PBS对照组比较,VP1-AP及VP3-VP1-AP组小鼠血清的中和抗体效价显著升高(q分别为7.79和25.11,P<0.01)。结论原核表达的HAV衣壳蛋白VP1和VP3纯度较高,且具有良好的免疫原性,制剂中添加CpG有利于增强抗原的免疫原性。本研究为HAV重组亚单位疫苗的研发奠定了基础。
文摘目的在悬浮CHO-S细胞中稳定表达重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法应用RT-PCR技术从BALB/c乳鼠股骨组织扩增mbmp7基因,克隆至质粒pMD18-T,通过定点突变3个氨基酸编码序列(G266S、S287N、D359E),得到重组克隆质粒pMD18-mbmp7m3;将mbmp7m3克隆至表达载体pCHO1.0,构建重组表达质粒pCHO-mbmp7m3,转染CHO-S细胞,利用嘌呤霉素和甲氨蝶呤进行两轮加压筛选,有限稀释法筛选单克隆细胞,ELISA法检测rhBMP7成熟蛋白的表达。结果从乳鼠股骨组织扩增的cDNA经测序与GenBank中登录的序列完全一致,点突变后测序与设计完全一致。获得了稳定表达rhBMP7成熟蛋白的单克隆细胞株,最高表达量为202 ng/mL。结论成功利用改造的mbmp7基因在CHO-S细胞中表达了rhBMP7成熟蛋白,为后续该制品工艺开发及产业化奠定了基础。
