不同谱系D型流感病毒HEF蛋白N-糖基化位点和B细胞表位预测分析

1

作者 蒋智勇 周霞 +6 位作者 李春玲 楚品品 勾红潮 李艳 卞志标 刘建营 翟少伦 《中国动物保健》 2024年第10期123-128,共6页

D型流感病毒(IDV)是一种近年来新发现的正粘病毒科D型流感病毒属成员,可引起牛、猪、豚鼠等多种动物的呼吸道疾病,具有潜在的人兽共患性。基于HEF基因遗传多样性,IDV可分为5个不同的谱系,分别是D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/... D型流感病毒(IDV)是一种近年来新发现的正粘病毒科D型流感病毒属成员,可引起牛、猪、豚鼠等多种动物的呼吸道疾病,具有潜在的人兽共患性。基于HEF基因遗传多样性,IDV可分为5个不同的谱系,分别是D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019谱系。不同于甲型、乙型流感病毒,IDV的潜在N-糖基化位点主要集中分布在HEF基因上。为系统了解不同谱系毒株HEF蛋白的N-糖基化位点和B细胞表位,从Gen Bank数据库获得151条全长HEF基因序列,通过使用MEGA-X生物信息学软件构建遗传进化树,并用在线工具进行各毒株N-糖基化位点和线性B细胞表位预测分析。结果表明IDV的HEF蛋白具有6~8个潜在的N-糖基化位点,其中有2个N-糖基化位点(N146和N613)在不同谱系间相同,有6个N-糖基化位点(N28、N54、N249、N346、N390和N513)在不同谱系间存在差异。B细胞表位在不同谱系间有3个保守的表位和8~9个各谱系独特的表位。线性B细胞表位的预测将有助于设计激活体液反应的多表位疫苗,预测结果还需要体外和体内实验证实来证明该应用的可行性。 展开更多

关键词 D型流感病毒 谱系 HEF蛋白 N-糖基化位点 B细胞表位 预测

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猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用 被引量：19

2

作者 朱俊灵 叶佐东 +2 位作者 邓洁汝 勾红潮 陈金顶 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-7,共7页

【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classica... 【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 NS5B基因 环介导等温扩增技术 横向流动试纸条技术 病毒检测

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猪链球菌ssnA基因缺失突变菌株的构建及毒力分析 被引量：2

3

作者 李淼 李春玲 +6 位作者 宋帅 杨冬霞 蔡汝健 李艳 蒋智勇 勾红潮 楚品品 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期1-6,共6页

分泌型核酸酶基因ssnA是近年来研究发现的一种脱氧核糖核酸酶,被认为是一种猪链球菌2型(SS2)潜在的毒力因子。为了分析ssnA基因对于SS2毒力的影响,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组构建了SS2流行毒力株... 分泌型核酸酶基因ssnA是近年来研究发现的一种脱氧核糖核酸酶,被认为是一种猪链球菌2型(SS2)潜在的毒力因子。为了分析ssnA基因对于SS2毒力的影响,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组构建了SS2流行毒力株GD01的ssnA基因缺失突变菌株,并通过比较分析了野生菌株与缺失突变菌株的生长特性及溶血活性等生物学特性。结果显示,GD01株与ΔssnA突变株的生长速度及溶血活性没有明显差异;ssnA基因缺失后SS2对Hep-2细胞的黏附及入侵能力则明显下降。小鼠毒力试验结果显示,ssnA基因缺失突变菌株对于CD1小鼠LD50是6.17×108cfu,而SS2野生菌株的LD50是4.42×107cfu,缺失突变株的LD50约是野生株的14倍,表明ssnA的缺失对SS2毒力产生明显影响,提示ssnA基因在其致病过程中具有重要作用,其具体作用机制需进一步分析。 展开更多

关键词 猪链球菌2型 ssnA基因 基因缺失 毒力

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非洲猪瘟病毒防污染双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：3

4

作者 卞志标 郭怡德 +5 位作者 席振军 柯海意 蔡汝健 孙铭飞 勾红潮 李春玲 《动物医学进展》 北大核心 2023年第1期19-26,共8页

荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术在非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测中发挥重要作用,然而该方法也存在一些局限性。一方面由于检测环境中易产生气溶胶污染,经常导致qPCR检测产生假阳性结果。另一方面,临床上已发现MGF基因缺失的变异株,现有的... 荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术在非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测中发挥重要作用,然而该方法也存在一些局限性。一方面由于检测环境中易产生气溶胶污染,经常导致qPCR检测产生假阳性结果。另一方面,临床上已发现MGF基因缺失的变异株,现有的检测方法将无法满足野毒株与变异株鉴别检测的需求。为了解决qPCR易产生假阳性,ASFV核酸检测靶标基因过分单一的问题,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。该检测方法根据C962R基因和MGF-505-2R基因的保守序列设计引物和探针,并在反应体系中加入UNG酶达到防污染的目的,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。结果表明,利用该方法对C962R基因和MGF-505-2R的基因标准品进行检测,该检测方法具有较好的鉴别诊断效果。该检测方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.99;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL的ASFV基因标准品;特异性强,与猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(Hoemophilus parasuis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)及猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)均无交叉反应;重复性较好,变异系数小于1.75%,使用该检测方法对194份临床组织样品检测,与商品化非洲猪瘟病毒抗原检测试剂盒比较,检测结果均为阴性,符合率为100%。该方法预期可用于ASFV野毒株与MGF-505-2R基因缺失株的鉴别诊断,为深入开展分子流行病学调查提供技术储备。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 荧光定量聚合酶链反应 MGF-505-2R基因

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猪瘟病毒C株截短E2基因在大肠杆菌中表达及免疫原性初步检测 被引量：4

5

作者 郑仲华 李东升 +6 位作者 姚俊庸 常艳 勾红潮 刘文俊 赵明秋 毛晶丹 陈金顶 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第5期12-16,共5页

本试验利用PCR技术,扩增得到猪瘟病毒(CSFV)C株E2基因的主要抗原片段A/D区549bp,将其酶切纯化后,与已酶切纯化的pET-32a进行16℃过夜连接,转化大肠杆菌BL21。从转化成功的氨苄培养板挑取合适菌落进行PCR,挑取目的条带正确的菌落加至LB... 本试验利用PCR技术,扩增得到猪瘟病毒(CSFV)C株E2基因的主要抗原片段A/D区549bp,将其酶切纯化后,与已酶切纯化的pET-32a进行16℃过夜连接,转化大肠杆菌BL21。从转化成功的氨苄培养板挑取合适菌落进行PCR,挑取目的条带正确的菌落加至LB培养基进行过夜培养后送测序。将测序正确的菌液划板,挑菌培养并用IPTG进行诱导表达。得到的蛋白进行SDS-PAGE,在约39ku位置有蛋白条带。将蛋白纯化后,分别利用自制兔抗CSFV阳性血清及临床检测阳性的猪抗CSFV阳性血清进行Western blotting检测,可见在39ku处有单一条带,表明表达的蛋白具有免疫原性。本试验结果为下一步ELSIA试剂盒的组装奠定基础,方便对猪场免疫猪群猪瘟抗体水平进行监控。 展开更多

关键词 猪瘟病毒C株 A D主要抗原区 截短表达

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胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法的建立与应用 被引量：1

6

作者 张昆丽 席振军 +5 位作者 徐民生 李艳 勾红潮 楚品品 蔡汝健 李春玲 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第2期114-119,共6页

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1&#... 为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×10^(2)CFU/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍;特异性结果显示,该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带,而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性;应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料,结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07%(7/41)和19.51%(8/41)。以上结果表明,本研究成功建立的APP纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好,可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。 展开更多

关键词 胸膜肺炎放线杆菌 纳米PCR 检测方法

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非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立 被引量：1

7

作者 施科达 徐民生 +8 位作者 李艳 张昆丽 翟少伦 勾红潮 宋帅 杨冬霞 臧莹安 孙铭飞 李春玲 《中国农学通报》 2023年第11期143-151,共9页

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-... 试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 B646L(P72)蛋白基因 锁核酸修饰 一步法巢式荧光定量PCR

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猪增生性肠炎的诊治 被引量：3

8

作者 徐民生 柯海意 +9 位作者 杨冬霞 宋帅 勾红潮 张昆丽 蒋智勇 李艳 楚品品 翟少伦 简运华 李春玲 《广东畜牧兽医科技》 2023年第1期35-38,共4页

广东省某规模化养猪场部分圈舍猪群发生腹泻、拉血便症状,病理解剖显示肠道组织肿大出血,死亡猪只粪便呈黑色煤焦油状。本文采集了病死猪只的粪便进行PCR检测和鉴定,结合发病症状,确定发病原因是由于胞内劳森菌引起的猪增生性肠炎。用... 广东省某规模化养猪场部分圈舍猪群发生腹泻、拉血便症状,病理解剖显示肠道组织肿大出血,死亡猪只粪便呈黑色煤焦油状。本文采集了病死猪只的粪便进行PCR检测和鉴定,结合发病症状,确定发病原因是由于胞内劳森菌引起的猪增生性肠炎。用药物泰妙菌素进行临床治疗,结合其他药物辅助治疗,猪群健康状况逐渐趋于稳定。 展开更多

关键词 猪增生性肠炎 胞内劳森菌 诊断 综合防治

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非洲猪瘟病毒蛋白功能研究进展 被引量：20

9

作者 郭怡德 李冰 +9 位作者 蔡汝健 蒋智勇 宋帅 勾红潮 李艳 楚品品 杨冬霞 卞志标 李春玲 臧莹安 《动物医学进展》 北大核心 2020年第10期96-101,共6页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的猪的高度接触性传染病。ASFV编码的蛋白超过200个,pp220、pp62、p10、p12、p14.5、p17、p22、p30、p49、p54、p72、CD2v、pE248R、pM... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的猪的高度接触性传染病。ASFV编码的蛋白超过200个,pp220、pp62、p10、p12、p14.5、p17、p22、p30、p49、p54、p72、CD2v、pE248R、pM1249L、pH240R和j5R是病毒的组装和形成的主要结构蛋白,其中CD2v、p12、p30和p54是ASFV的重要毒力蛋白;已知的非结构蛋白有DP71L、A238L、9GL、pE296R、Ep152R、L38L、DP9GR、A179L、pI215L和PE165R,这些蛋白是ASFV干扰宿主细胞正常代谢和免疫逃避的关键因素。对ASFV蛋白功能的深入了解有助于研究ASFV的致病机制及防控方法。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 结构蛋白 非结构蛋白 蛋白功能

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脂多糖修饰对革兰阴性菌毒力及外膜囊泡生物学特性影响的研究进展 被引量：4

10

作者 杨君 李冰 +7 位作者 蔡汝健 宋帅 勾红潮 楚品品 卞志标 王令 闫鹤 李春玲 《动物医学进展》 北大核心 2020年第2期98-103,共6页

脂多糖(LPS)是革兰阴性(G^-)菌的内毒素,刺激机体引发炎症反应,为细菌的一种毒力因子,主要存在于细菌细胞壁外膜上,也是外膜囊泡(OMVs)的主要成份。OMVs是细菌从膜上脱落下来的一种囊状结构,含有大量的LPS、外膜蛋白及其他成分,具有良... 脂多糖(LPS)是革兰阴性(G^-)菌的内毒素,刺激机体引发炎症反应,为细菌的一种毒力因子,主要存在于细菌细胞壁外膜上,也是外膜囊泡(OMVs)的主要成份。OMVs是细菌从膜上脱落下来的一种囊状结构,含有大量的LPS、外膜蛋白及其他成分,具有良好的免疫原性,被认为是最具潜力的亚单位疫苗。大多数LPS由类脂A、核心寡糖和O抗原多糖组成,这3个组分的合成影响着LPS的结构,继而影响细菌的毒力和细菌分泌OMVs的产量、毒性及免疫原性等生物学特性。论文主要对LPS的合成转运过程中结构修饰对G^-菌毒力及其OMVs生物学特性的影响进行综述,为革兰阴性菌致病机理研究及开发新型亚单位疫苗提供新思路。 展开更多

关键词 脂多糖 结构 革兰阴性菌 毒力 外膜囊泡 生物学特性

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MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响 被引量：1

11

作者 谢思豪 勾红潮 +4 位作者 卞志标 李斌 蔡汝健 臧莹安 李春玲 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1934-1941,共8页

【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利... 【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。 展开更多

关键词 MLKL基因 CRISPR/Cas9基因编辑技术 敲除 PK-15细胞 猪伪狂犬病病毒(PRV)

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华南地区猪圆环病毒3型分子流行病学研究 被引量：14

12

作者 蒋智勇 蔡汝健 +5 位作者 楚品品 林德锐 勾红潮 李艳 宋帅 李春玲 《广东农业科学》 CAS 2018年第7期116-120,共5页

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒类型,为了解PCV3在华南地区的分布及其分子流行病学,应用荧光定量PCR方法对华南地区的临床样品进行检测,然后对PCV3阳性样品进行全基因组扩增和测序,将获得的7株PCV3核酸序列与国内外参考毒株... 猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒类型,为了解PCV3在华南地区的分布及其分子流行病学,应用荧光定量PCR方法对华南地区的临床样品进行检测,然后对PCV3阳性样品进行全基因组扩增和测序,将获得的7株PCV3核酸序列与国内外参考毒株进行遗传变异分析。结果表明,华南地区送检的临床样品和猪场的PCV3阳性率分别为46.3%和69.2%,7株PCV3毒株与国内外的参考毒株同源性为97.4%~99.8%,而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为96.6%~99.8%和96.7%~99.5%。由此可见,PCV3在我国华南地区已经广泛存在。 展开更多

关键词 猪圆环病毒3型 全基因序列 PCR检测 分子流行病学 华南地区

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猪链球菌临床分离株对四环素类抗生素的耐药性和耐药基因分析 被引量：12

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作者 刘宝玲 楚品品 +6 位作者 李春玲 杨冬霞 蒋智勇 张昆丽 宋帅 勾红潮 蔡汝健 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第7期2796-2804,共9页

【目的】了解广东地区猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)临床分离株对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因携带情况。【方法】采用药敏纸片扩散法对2016-2020年分离自广东地区的34株猪链球菌进行四环素类抗生素耐药分析,并通过PCR方法... 【目的】了解广东地区猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)临床分离株对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因携带情况。【方法】采用药敏纸片扩散法对2016-2020年分离自广东地区的34株猪链球菌进行四环素类抗生素耐药分析,并通过PCR方法检测四环素耐药基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX携带情况。【结果】34株猪链球菌对四环素的耐药率高达100%(34/34),其次为米诺环素82.4%(28/34)、多西环素47.1%(16/34)。34株猪链球菌中3重耐药菌株有15株,占比44.1%(15/34),2重耐药菌株有14株,占比41.1%(14/34),耐1种药物的菌株5株,占比14.7%(5/34)。耐药基因检测结果显示,tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX基因携带率分别为0、0、0、14.7%(5/34)、100%(34/34)和0。【结论】广东地区猪链球菌临床分离株四环素类抗生素的耐药率较高,主要携带的四环素耐药基因为tetO和tetM基因。 展开更多

关键词 猪链球菌 四环素类抗生素 耐药性 耐药基因

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副猪嗜血杆菌lpxM基因缺失株构建及生物学特性分析 被引量：4

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作者 杨君 楚品品 +8 位作者 宋帅 蔡汝健 杨冬霞 卞志标 勾红潮 李艳 蒋智勇 李春玲 闫鹤 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第16期3394-3403,共10页

【目的】研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物... 【目的】研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物选择时提供依据。【方法】以高致病性血清5型HPS地方分离株H45为研究对象,自杀性质粒PK18mobsacB为载体,通过自然转化法将构建好的重组质粒转进H45,使其在抗生素的压力下发生同源重组,最终经过抗生素筛选并通过PCR和测序验证得到lpxM基因缺失株H45-△lpxM,比较两者之间部分生物学特性的差异。测定两者的OD600-t关系曲线比较生长情况;用结晶紫染色法比较两者在培养24h后生物被膜形成的能力;测定两者在50%猪血清中存活率,比较两者的抗血清补体杀菌能力;将两者同时刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,作用时间为6、12和24h,检测细胞培养上清液中LDH的释放量,比较两者对巨噬细胞毒力影响;利用K-B纸片扩散法研究两者对氨苄西林等临床上常用13种抗生素和多粘菌素B抗生素敏感性,通过测定抑菌圈直径来并参照耐药标准判断对抗生素的敏感性。【结果】成功构建lpxM基因缺失株H45-△lpxM,生长情况比较发现菌株生长前期缺失株慢于野生株,8h后保持一致,结果表明lpxM基因缺失能在一定程度上抑制H45的生长;两者均能形成生物被膜,但是缺失株弱于野生株;野生菌株在50%猪血清中存活率为16.1%,而缺失株只有0.71%,缺失株明显低于野生菌株;两者均能引起巨噬细胞的死亡,作用6、12和24h后,野生株对细胞的致死率分别为6.63%、10.86%和22.17%,而缺失株对细胞的致死率为2.62%、6.35%和18.01%,结果表明随着作用时间的延长,两者对细胞的毒力作用越来越大,具有一定的时间依赖性,在各个时间点,缺失株的毒力作用均低于野生株;抗生素敏感性结果发现,两者对头孢噻吩等10种抗生素均表现敏感,对恩诺沙星均表现抗性,但对阿莫西林克拉维酸、磺胺二甲异噁唑和氨苄西林三种抗生素的耐药性发生了较大的差异,阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异噁唑两种抗生素由耐药变成了敏感,氨苄西林也从中介变成敏感,结果表明lpxM基因缺失对H45抗生素敏感性具有一定影响。【结论】lpxM基因缺失能一定程度地抑制HPS生长,降低其生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力和对巨噬细胞的毒力作用,增大对临床上多数常用抗生素的敏感性,揭示lpxM基因可能是HPS毒力基因,与HPS的致病能力密切有关,但具体机制还需要进一步研究。 展开更多

关键词 副猪嗜血杆菌 lpxM基因 生物被膜 抗血清杀菌 细胞毒性 抗生素耐药性

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动物细胞规模化培养技术现状 被引量：8

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作者 楚品品 蒋智勇 +5 位作者 勾红潮 宋帅 李淼 李艳 李春玲 蔡汝健 《动物医学进展》 北大核心 2018年第2期119-123,共5页

随着对蛋白质类药物和疫苗等众多基于细胞培养的生物制品需求量及质量要求的不断提高,多种动物细胞规模化培养技术应运而生并不断发展,尤其悬浮培养技术的出现,成功突破了动物细胞规模化培养的传统障碍。了解不同动物细胞规模化培养技术... 随着对蛋白质类药物和疫苗等众多基于细胞培养的生物制品需求量及质量要求的不断提高,多种动物细胞规模化培养技术应运而生并不断发展,尤其悬浮培养技术的出现,成功突破了动物细胞规模化培养的传统障碍。了解不同动物细胞规模化培养技术(尤其悬浮培养技术)的发展及优缺点,诸如适于单细胞全悬浮培养的贴壁细胞的筛选驯化,微载体技术的突破,无血清乃至化学成分限定性培养基的开发,生物反应器的更新,以及连续培养及灌注培养的改进等,选择合适的规模化培养技术,实现细胞的高密度培养,将更好的应对生物制药行业的发展及需求。 展开更多

关键词 规模化细胞培养技术 悬浮培养技术 生物反应器 高密度培养

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猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立 被引量：5

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作者 李艳 楚品品 +7 位作者 雷雯 勾红潮 蒋智勇 蔡汝健 宋帅 卞志标 杨东霞 李春玲 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第1期36-41,共6页

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测... 本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测下限为10个拷贝/μL;批内变异系数和批间变异系数分别为0.43%~0.64%、0.44%~2.34%,重复性良好。对67份临床样品进行检测,病毒分离培养法检测出23份阳性样品,LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法检测出26份阳性样品,常规TaqMan探针法检测出21份阳性样品,与病毒分离法比较,LNA-TaqMan探针法的符合率为96%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针检测猪伪狂犬病病毒野毒株的荧光定量PCR方法,为猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查提供了可靠的技术支持。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病病毒 GE基因 LNA探针 实时荧光定量PCR

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不同PRRS疫苗组合对仔猪免疫效果的研究 被引量：3

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作者 蔡汝健 蒋智勇 +5 位作者 勾红潮 楚品品 李艳 宋帅 徐志宏 李春玲 《广东农业科学》 CAS 2019年第10期93-98,共6页

【目的】针对猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)毒株存在多样性和疫苗免疫效果不佳的问题,探索PRRS疫苗对仔猪最佳免疫方案。【方法】分别在A、B、C 3个猪场开展试验,每个猪场采用4种不同的PRRS... 【目的】针对猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)毒株存在多样性和疫苗免疫效果不佳的问题,探索PRRS疫苗对仔猪最佳免疫方案。【方法】分别在A、B、C 3个猪场开展试验,每个猪场采用4种不同的PRRS疫苗组合:第1种,14日龄同时免疫PRRS弱毒苗和灭活苗;第2种,4日龄免疫PRRS弱毒苗和35日龄免疫灭活苗;第3种,14日龄和35日龄免疫弱毒苗;第4种,14日龄免疫弱毒苗。通过免疫后的抗体滴度、病毒血症和生产参数评估PRRS疫苗免疫效果。【结果】不同免疫组合比较发现,A2、B3、C3抗体水平最高,S/P值分别为2.50、2.63和2.99;A2、B2、B3、C1血清中PRRSV核酸阳性率最低,分别为12.5%、0、0、6.3%;A1、B2、C1发病率最低,分别为10%、2%和8%。【结论】14日龄同时免疫PRRS弱毒苗和灭活苗,14日龄免疫PRRS弱毒苗和35日龄免疫灭活苗,两种免疫组合免疫效果最好。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征 免疫方案 抗体滴度 病毒血症 免疫效果

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猪链球菌毒力因子研究进展 被引量：5

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作者 林玲 李春玲 +5 位作者 臧莹安 蔡汝健 宋帅 勾红潮 楚品品 徐志宏 《动物医学进展》 北大核心 2020年第9期82-86,共5页

猪链球菌作为条件致病菌,能引起人兽共患病,该病可在全球广泛流行,并导致严重疫情,研究发现该菌有很多毒力因子与细菌感染和致病密切相关。论文总结了猪链球菌的毒力因子H因子结合蛋白、荚膜唾液酸、猪链球菌富丝氨酸重复蛋白1、血红素... 猪链球菌作为条件致病菌,能引起人兽共患病,该病可在全球广泛流行,并导致严重疫情,研究发现该菌有很多毒力因子与细菌感染和致病密切相关。论文总结了猪链球菌的毒力因子H因子结合蛋白、荚膜唾液酸、猪链球菌富丝氨酸重复蛋白1、血红素结合蛋白SntA、菌毛蛋白、寡肽结合蛋白、烟酰胺单核苷酸转运蛋白PnuC、二肽基肽酶-4、5′-核苷酸酶、猪链球菌IgM降解酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、VraSR调控系统、Spx蛋白、murB-potABCD操纵子、virD4-virB4分泌系统的研究进展,期待该菌毒力因子的研究能为疫苗和药物的开发提供思路。 展开更多

关键词 猪链球菌 毒力因子 致病机制

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鼻内黏膜免疫研究进展 被引量：4

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作者 李艳 楚品品 +5 位作者 蒋智勇 蔡汝健 勾红潮 宋帅 杨冬霞 李春玲 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期39-43,共5页

大多数病原体在机体的黏膜表面起始感染,因此黏膜免疫是机体抵御感染的第一道防线。黏膜免疫可通过多种途径实现,经鼻黏膜途径免疫是其中一种。鼻内黏膜免疫是机体抵抗呼吸道病原感染最有效的途径,它不仅能诱导局部黏膜免疫反应,还可诱... 大多数病原体在机体的黏膜表面起始感染,因此黏膜免疫是机体抵御感染的第一道防线。黏膜免疫可通过多种途径实现,经鼻黏膜途径免疫是其中一种。鼻内黏膜免疫是机体抵抗呼吸道病原感染最有效的途径,它不仅能诱导局部黏膜免疫反应,还可诱导全身系统免疫反应,是当前预防呼吸道疾病的研究热点。文章对鼻内黏膜免疫系统、M细胞介导的抗原摄取及转运、鼻黏膜免疫的运载系统及鼻黏膜免疫的应用等研究进展进行简要的介绍。 展开更多

关键词 局部黏膜免疫反应 系统免疫反应 鼻内黏膜免疫 M细胞 运载系统

原文传递

基因重组技术在猪伪狂犬病毒基因工程疫苗中的研究进展 被引量：2

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作者 柯海意 王帅 +5 位作者 徐民生 蔡汝健 勾红潮 臧莹安 李春玲 简运华 《广东农业科学》 CAS 2021年第5期124-131,共8页

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的急性高度接触性传染病,可造成不同日龄的猪发病,给养猪业造成了严重的经济损失。预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病的主要措施之一是疫苗免疫接种。通过基因重组技术对PR... 猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的急性高度接触性传染病,可造成不同日龄的猪发病,给养猪业造成了严重的经济损失。预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病的主要措施之一是疫苗免疫接种。通过基因重组技术对PRV关键毒力基因进行改造,敲除毒力基因或插入免疫增强基因,是降低PRV毒力或提高病毒免疫保护效果的有效方法之一,也是研制安全高效PRV基因工程疫苗的重要手段。从基因同源重组、Cre/lox P位点特异性重组、细菌人工染色体和CRISPR基因编辑等不同基因重组技术应用方面对猪PRV基因工程疫苗的研制进行综述,为PRV重组疫苗的进一步深入研究提供参考。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病毒 基因工程疫苗 基因编辑 同源重组 位点特异 CRISPR

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