表达鸡传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组嵌合型新城疫病毒La Sota株的构建

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作者 田静格 徐鸣荷 +16 位作者 王向东 张意航 李岩 刘俊杰 李星雨 韩城昊 张伯顺 卜德新 于春梅 丛雁方 杨盼盼 乔麒龙 王增 李建丽 李永涛 王白玉 赵军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期659-665,共7页

为构建表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)的重组新城疫病毒(NDV)La Sota株,本研究将ILTV强毒株gD基因胞外域与NDV F基因信号肽、跨膜域和胞质尾区融合,并插入到含有NDV基因VII型F和HN基因的嵌合型La Sota株感染性cDNA克隆pLa S... 为构建表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)的重组新城疫病毒(NDV)La Sota株,本研究将ILTV强毒株gD基因胞外域与NDV F基因信号肽、跨膜域和胞质尾区融合,并插入到含有NDV基因VII型F和HN基因的嵌合型La Sota株感染性cDNA克隆pLa Sota-VIIF/HN的P和M基因之间,将获得的重组感染性克隆pLa Sota-VIIF/HN-gD与辅助质粒pCIneo-NP-P-L共转染BHK-21细胞,拯救出表达gD蛋白的重组嵌合型NDV La Sota株rLaSota-VIIF/HN-gD,并采用血凝试验鉴定正确后,将重组病毒在9日龄SPF鸡胚中连续传至10代,提取10代重组病毒基因组RNA,反转录成c DNA作为模板,以ILTV gD基因插入位点两侧的鉴定引物进行PCR鉴定;采用第10代重组病毒感染BHK-21细胞,以ILTV gD蛋白多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光试验(IFA);分别对鸡红细胞吸附的重组病毒感染的鸡胚尿囊液上清和从红细胞上解离下来的纯化的重组NDV病毒粒子经western blot鉴定,并对重组病毒对鸡胚的致病性和在鸡胚中的复制动态进行初步研究。PCR结果显示ILTV gD基因能够在重组病毒中稳定存在;IFA和western blot鉴定结果显示,重组病毒能够正确表达ILTV的gD蛋白,而且gD蛋白嵌合表达在重组病毒颗粒上。鸡胚致病性试验和鸡胚中的复制动态试验结果显示,重组病毒保持了La Sota疫苗株的低致病性和良好的复制特性,rLaSota-VIIF/HN-gD的鸡胚平均死亡时间(MDT)为168 h,1日龄雏鸡脑内接种该重组病毒的致病指数(ICPI)为0.20,鸡胚半数感染量(EID_(50))峰值可达10^(-8.66)/100μL。本研究所制备的重组病毒r LaSota-VIIF/HN-gD为研制基因VII型NDV和ILTV的二联活疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 传染性喉气管炎病毒 重组嵌合型新城疫病毒 gD蛋白 二联活疫苗

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1株鸡毒支原体的分离鉴定及致病性研究

2

作者 张伯顺 卜德新 +5 位作者 吕虹雨 黄冬 王睿智 于春梅 王进江 丛雁方 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第3期50-56,共7页

为了对1株从鸡场分离到的鸡毒支原体(MG)进行遗传进化分析及致病性研究。用MG的16S rRNA引物对山东省莱西市某鸡场疑似MG感染的气囊病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性条带。通过病原分离培养、16S rRNA基因测序比对获得MG分离株,命... 为了对1株从鸡场分离到的鸡毒支原体(MG)进行遗传进化分析及致病性研究。用MG的16S rRNA引物对山东省莱西市某鸡场疑似MG感染的气囊病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性条带。通过病原分离培养、16S rRNA基因测序比对获得MG分离株,命名为SDMg01株;低倍显微镜观察到,菌落呈典型的“荷包蛋”状;生化鉴定结果表明,该分离株能发酵葡萄糖,不水解精氨酸,不利用尿素。对分离株16S rRNA序列进行MEGA分析和构建系统进化树发现SDMg01分离株与其他MG菌株在同一进化分支上,其中与MG参考菌株(PG31)相似性为99.8%。对分离株SDMg01进行动物试验,感染8周龄的SPF鸡14 d后进行解剖,观察临床症状及气囊病理学变化;结果表明,SDMg01分离株致病性较强,可引起典型的气囊炎。本研究为MG诊断试剂的研制和疫苗候选毒株的筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 鸡毒支原体 16S rRNA 系统进化树 致病性

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禽4型腺病毒knob蛋白的原核表达及纯化蛋白的免疫原性研究

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作者 黄冬 卜德新 +3 位作者 王睿智 张伯顺 于春梅 丛雁方 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第5期87-92,共6页

为研究Knob蛋白的免疫效果,将合成的mknob基因克隆至pET28a(+)表达载体,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,低温诱导表达,knob蛋白纯化后去内毒素,按不同剂量免疫SPF鸡。结果表明:重组质粒pET28a-mknob可以高效表达目的蛋白;Western blot结... 为研究Knob蛋白的免疫效果,将合成的mknob基因克隆至pET28a(+)表达载体,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,低温诱导表达,knob蛋白纯化后去内毒素,按不同剂量免疫SPF鸡。结果表明:重组质粒pET28a-mknob可以高效表达目的蛋白;Western blot结果表明,表达的蛋白可与禽腺病毒特异性血清发生特异性结合;免疫保护试验分析发现,10μg蛋白免疫SPF鸡即可产生100%保护。本研究为禽4型腺病毒亚单位疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 禽4型腺病毒 knob蛋白 原核表达 纯化 免疫原性

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两株H1亚型猪流感病毒对猪的致病能力分析 被引量：2

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作者 卜德新 张伟东 +7 位作者 卜春玲 黄俊明 蔡孟楷 曹振鹏 方博 付新亮 亓文宝 张桂红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期784-788,共5页

为研究H1亚型猪流感病毒分离株A/Swine/Guangdong/SS1/2012(H1N1,SS1)和A/Swine/Guangdong/YJ28/2014(H1N2,YJ28)的致病力,本研究对2株病毒基因组进行分析,并将2株病毒分别通过滴鼻途径感染仔猪后观察临床症状,在攻毒后4 d与7 d迫杀实... 为研究H1亚型猪流感病毒分离株A/Swine/Guangdong/SS1/2012(H1N1,SS1)和A/Swine/Guangdong/YJ28/2014(H1N2,YJ28)的致病力,本研究对2株病毒基因组进行分析,并将2株病毒分别通过滴鼻途径感染仔猪后观察临床症状,在攻毒后4 d与7 d迫杀实验猪采集脏器样品,检测脏器病毒滴度,进行肺病理切片观察和免疫组化实验,比较2株猪流感病毒对猪的致病能力和排毒情况。遗传进化结果显示,SS1分离株8个节段均属于欧亚类禽分支,YJ28为欧亚类禽、pdm/09和人季节性流感的新型重组病毒。动物实验结果显示,两株猪流感病毒均能够在猪只上复制,临床症状均不明显。鼻拭子排毒检测结果显示,YJ28组猪排毒仅持续至感染后第6 d,但SS1组猪在整个实验周期均能检测到排毒。实验猪脏器病毒检测和病理切片结果显示,SS1组相比于YJ28组脏器病毒滴度更高,且造成更严重的肺部病理损伤。本实验分离株SS1相比YJ28在PB2基因出现D^(701)N突变,这或许是SS1比YJ28具有更强致病能力和更长排毒周期的原因。本研究结果为H1N1和H1N2猪流感病毒对猪的致病能力和排毒情况提供实验依据。 展开更多

关键词 H1亚型 猪流感病毒 病毒滴度 致病性

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3株H1N1亚型猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原特异性分析

5

作者 秦锋 蔡孟楷 +9 位作者 张伟东 张京 方博 黄俊明 卜德新 罗勇峰 马骏 付新亮 曹振鹏 张桂红 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期13-18,共6页

【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比... 【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比较分析3株H1N1亚型HA基因片段的遗传信息,制备全病毒灭活疫苗,各免疫3只雌性新西兰大白兔,采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)反应试验检测抗体滴度。【结果】3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性为69.4%~89.1%,各分支的HA基因的抗原表位存在差异;3株病毒经过2次免疫后平均HI抗体滴度均能达1 280以上,且SWSS1的平均HI抗体滴度高达2 560。同时SWSS1与SWL6、Pdm091057这2株病毒均无血清学交叉反应,而SWL6与Pdm091057有较低的血清学交叉反应。【结论】3株猪流感病毒的HA基因片段抗原表位存在着差异,可能是3毒株之间血清学交叉反应较低的原因。3株病毒免疫原性均较好,可作为候选疫苗株。 展开更多

关键词 猪流感病毒 H1N1 遗传信息 抗原表位 血凝抑制 抗体滴度 HA基因

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华南地区猪群猪流感病毒病原学和血清学调查 被引量：5

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作者 付新亮 方博 +3 位作者 蔡孟楷 黄俊明 卜德新 张桂红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期23-28,共6页

为了解华南地区猪群中猪流感病毒(SIV)的流行及其遗传变异情况,本研究从2016年~2017年广东、广西等地猪群236份猪肺脏病料组织和143份鼻拭子样品中分离鉴定得到3株SIV,全基因组测序和遗传演化分析结果显示,3个分离株均属于H1N1亚型欧亚... 为了解华南地区猪群中猪流感病毒(SIV)的流行及其遗传变异情况,本研究从2016年~2017年广东、广西等地猪群236份猪肺脏病料组织和143份鼻拭子样品中分离鉴定得到3株SIV,全基因组测序和遗传演化分析结果显示,3个分离株均属于H1N1亚型欧亚类禽分支SIV,并且均与pdm09分支病毒株发生了重组。HA蛋白分子特征分析结果显示,A/Swine/Guangxi/NK/2016 HA蛋白第23位糖基化位点发生了缺失。3265份血清样品抗体监测结果显示,欧亚类禽H1N1、pdm09 H1N1和H3N2 SIV的血清抗体阳性率分别为27.53%、20.98%和34.85%。另外,0.64%的(21份)血清样品为H9N2亚型流感病毒抗体阳性,并且猪群中不同亚型和不同分支SIV之间混合感染的情况非常普遍。猪群中流感病毒血清抗体监测结果显示,EA H1N1、pdm09和H3N2亚型SIV HI抗体滴度最高均可达到1:1280,而H9N2亚型HI抗体滴度最高为1:160,表明H9N2 AIV虽然可以感染猪,但对猪还不适应。各月份的血清抗体阳性率分析显示,SIV的流行具有季节性,冬季(11月、12月和1月份)的流行最为严重。本研究可为华南地区猪群SI防控及疫苗株的筛选提供参考依据。 展开更多

关键词 猪流感病毒 重组 流行病学 遗传演化

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广州市活禽市场7株H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析 被引量：2

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作者 蔡孟楷 张伟东 +7 位作者 秦锋 卜德新 黄俊明 冀池海 方博 付新亮 曹振鹏 张桂红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期152-155,共4页

为了解广州市活禽交易市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异特点和流行情况,本研究对2015年5月~2016年6月分离的7株H9N2亚型AIV进行全基因组的遗传进化分析。结果显示,7株H9N2亚型AIV均属于G57基因型,其中有4株分离株的部分内部基因与人源... 为了解广州市活禽交易市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异特点和流行情况,本研究对2015年5月~2016年6月分离的7株H9N2亚型AIV进行全基因组的遗传进化分析。结果显示,7株H9N2亚型AIV均属于G57基因型,其中有4株分离株的部分内部基因与人源H7N9亚型病毒株基因的核苷酸同源性在99%以上。HA裂解位点未发现碱性氨基酸的替换,HA潜在糖基化位点存在添加或缺失现象,HA蛋白aa155位和aa226位分别为苏氨酸(T)和亮氨酸(L),具有结合人流感病毒受体能力。NA蛋白颈部存在氨基酸缺失,M1蛋白N^(30)D、T^(139)A、T^(215)A,NS1蛋白P^(42)S等突变可能会增加病毒的致病性。结果表明广州市活禽交易市场H9N2亚型AIV的基因型趋于稳定,但其糖基化位点和受体结合位点等呈现多样化,并且H9N2亚型AIV的内部基因能够为其它亚型AIV提供内部片段,其对养殖行业及人类健康产生潜在威胁,仍需对其进行持续的监测。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H9N2 活禽交易市场 遗传进化分析

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1株禽滑液囊支原体分离鉴定及生物学特性分析

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作者 马丰英 卜德新 +6 位作者 马爱琴 张伯顺 迟丽丽 丛雁方 于春梅 韩娜 杜海霞 《养禽与禽病防治》 2024年第9期17-24,共8页

自某鸡场脚垫肿胀的病鸡中分离出1株支原体菌,经形态学、培养特性、血清学特性、鸡红细胞吸附、生化特性以及基因鉴定等生物学特性分析确定其为禽滑液囊支原体,命名为MS01株,并测定其生长曲线。对该菌株进行鸡胚感染和毒力试验,结果显... 自某鸡场脚垫肿胀的病鸡中分离出1株支原体菌,经形态学、培养特性、血清学特性、鸡红细胞吸附、生化特性以及基因鉴定等生物学特性分析确定其为禽滑液囊支原体,命名为MS01株,并测定其生长曲线。对该菌株进行鸡胚感染和毒力试验,结果显示接种鸡胚全部死亡,SPF鸡10/10发病,表明MS01株毒力较强;免疫原性试验中用该菌株制备的疫苗可100%抵御禽滑液囊支原体的攻击,具较好免疫原性。本研究为今后禽滑液囊支原体疾病的诊断和疫苗的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 禽滑液囊支原体 分离 鉴定 生物学特性 毒力 免疫原性

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2012-2015年江西省猪群H1与H3亚型流感病毒血清学调查 被引量：1

9

作者 甘平 秦锋 +7 位作者 卜德新 方博 马骏 罗勇峰 付新亮 曹振鹏 陈济铛 张桂红 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期1852-1855,1867,共5页

为了解江西省猪流感病毒的流行情况,通过血凝抑制试验(Hemagglutination Inhibition Test,HAI),我们检测了2012年至2015年间收集的2 005份血清样品中的H1和H3亚型流感病毒的抗体。结果显示,江西省猪群血清中的H1和H3亚型流感病毒的血清... 为了解江西省猪流感病毒的流行情况,通过血凝抑制试验(Hemagglutination Inhibition Test,HAI),我们检测了2012年至2015年间收集的2 005份血清样品中的H1和H3亚型流感病毒的抗体。结果显示,江西省猪群血清中的H1和H3亚型流感病毒的血清抗体阳性率分别为34.76%(697/2005,95%CI 32.68%~36.89%)和23.69%(475/2005,21.84%~25.61%),H1和H3亚型流感病毒共感染的阳性率为6.78%(136/2005,5.72%~7.97%)。通过对不同分支流感病毒的血清抗体阳性率统计分析后发现,江西省内不同地区内流感病毒呈现明显的地域性流行,并且2012年以来,全省pdm/09的血清抗体阳性率由36.74%(32.18%~41.50%)下降到20.44%(17.14%~24.06%),H3亚型的流感病毒抗体阳性率由4.85%(1.59%~10.97%)上升到41.24%(37.08%~45.49%),江西省猪群中流行的主要分支发生变化。本研究为江西省流感病毒的监测与预防提供了全面的数据支持。 展开更多

关键词 猪流感病毒 血凝抑制试验 血清学调查

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2株H1N1猪流感病毒的遗传进化分析及其生物致病性 被引量：3

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作者 黄俊明 蔡孟楷 +4 位作者 李琪 卜德新 方博 冀池海 张桂红 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1833-1839,共7页

对挑选的2株猪流感病毒A/swine/Guangdong/BRT15/2016（H1N1,BRT15）和A/swine/Guangdong/YJ4/2014（H1N1,YJ4）进行遗传进化分析与小鼠致病性试验。全基因组序列的遗传进化分析结果显示,BRT15与YJ4的HA、NA、M基因属于欧亚类禽猪源流... 对挑选的2株猪流感病毒A/swine/Guangdong/BRT15/2016（H1N1,BRT15）和A/swine/Guangdong/YJ4/2014（H1N1,YJ4）进行遗传进化分析与小鼠致病性试验。全基因组序列的遗传进化分析结果显示,BRT15与YJ4的HA、NA、M基因属于欧亚类禽猪源流感病毒分支,NP、PA、PB1和PB2基因属于pdm/09分支,NS基因属于北美三元重组分支。分别将BRT15与YJ4感染BALB/c小鼠进而比较分离株对小鼠的致病力,结果显示BRT15与YJ4毒株对小鼠具有不同的致病力,YJ4攻毒组小鼠死亡率高于BRT15组。肺部滴度检测显示,感染病毒后3d,YJ4组病毒滴度显著高于BRT15（P〈0.01）,感染病毒后6d,YJ4和BRT15组病毒滴度无明显差异（P〉0.05）;脑部滴度检测显示,感染病毒后3,6d,YJ4组和BRT15组病毒滴度均无明显差异（P〉0.05）。 展开更多

关键词 H1N1猪流感病毒 遗传进化分析 重组 致病性

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类禽H1N1亚型与Pdm/09H1N1亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及其遗传进化分析 被引量：1

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作者 秦锋 蔡孟楷 +7 位作者 黄俊明 方博 卜德新 罗永峰 付新亮 曹振鹏 马俊 张桂红 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期113-120,共8页

为了解猪流感病毒（SIV）的流行情况，本试验在2014年10月-2015年9月期间在广东省各地区采集猪的鼻拭子和肺脏病料，将样品处理之后进行鸡胚分离和RT-PCR检测，分离到1株SIV，对其进行全基因组测序和遗传进化分析，结果表明为H1N1亚型SI... 为了解猪流感病毒（SIV）的流行情况，本试验在2014年10月-2015年9月期间在广东省各地区采集猪的鼻拭子和肺脏病料，将样品处理之后进行鸡胚分离和RT-PCR检测，分离到1株SIV，对其进行全基因组测序和遗传进化分析，结果表明为H1N1亚型SIV，病毒HA，NA，M和NS基因片段属于类禽分支（EA），病毒PB2、PB1、PA和NP基因片段属于Pdm／09分支。HA基因序列同源性结果显示，核苷酸相似性为93．2％～99．1％，其中与A／swine／Jiangxi／3858／2011（H1N1）SIV同源性最高。抗原位点分析结果表明，分离毒株的抗原位点基本保守。本研究通对广东省各地区分离的SIV分析，为SIV的重组和变异趋势及公共卫生安全的防控提供依据。 展开更多

关键词 猪流感病毒 RT-PCR 遗传进化分析 重组病毒 抗原位点

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