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IDH1基因在肝内胆管癌细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其初步机制
1
作者 林美佳 雷宇清 +3 位作者 叶洲杰 朱丽萍 王心睿 黄雄飞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期194-203,共10页
目的探讨异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)在肝内胆管癌(iCCA)细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其可能的分子机制。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IDH1基因敲除的HuCCT1细胞(HuCCT1^(IDH1-/-));CCK-8法和克隆形成实验检测IDH1野生型HuCCT1(Hu... 目的探讨异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)在肝内胆管癌(iCCA)细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其可能的分子机制。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IDH1基因敲除的HuCCT1细胞(HuCCT1^(IDH1-/-));CCK-8法和克隆形成实验检测IDH1野生型HuCCT1(HuCCT1^(WT))细胞和HuCCT1^(IDH1-/-)细胞的增殖能力;细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blotting检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平。生物信息学方法分析上述两种HuCCT1细胞的转录组测序结果,Western blotting验证转录组信息通路相关蛋白的表达。结果与HuCCT1细胞比较,HuCCT1^(IDH1-/-)细胞增殖和克隆形成数目明显减少(P<0.05),阻滞在G_(2)/M期细胞的比例明显增加(P<0.01),划痕愈合率明显降低(P<0.01),迁移细胞数目(P<0.001)和侵袭细胞数目(P<0.05)明显减少;q RT-PCR检测结果显示,HuCCT1^(IDH1-/-)细胞IDH1、Vimentin、MMP-9和调控G_(2)/M期增殖相关基因Cyclin A2、Cyclin B1及CDK1 mRNA表达水平降低(P<0.05),编码E-cadherin的CDH1 mRNA表达水平升高(P<0.01);Western blotting检测结果显示,HuCCT1^(IDH1-/-)细胞中E-cadherin表达水平升高(P<0.05),N-cadherin、Vimentin及MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05)。转录组测序结果显示,HuCCT1^(WT)与HuCCT1^(IDH1-/-)存在1476个差异表达基因(DEGs);基因本体论(GO)分析显示上述DEGs显著富集在炎症反应、细胞信号转导和细胞代谢等生物学过程;KEGG通路分析显示上述DEGs显著富集在Wnt、MAPK、Rap1、Hippo、TNF等与肿瘤细胞增殖和侵袭转移密切相关的信号通路。Western blotting验证结果显示,与HuCCT1^(WT)比较,HuCCT1^(IDH1-/-)细胞Wnt信号通路的Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论IDH1基因参与调控iCCA细胞HuCCT1的迁移、侵袭及EMT过程,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。 展开更多
关键词 肝内胆管癌 异柠檬酸脱氢酶1 细胞迁移 细胞侵袭 转录组
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应用CRISPR/Cas9技术敲除甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞FHL1基因及转录组分析
2
作者 叶洲杰 王心睿 《福建医药杂志》 CAS 2023年第4期101-106,共6页
目的 探究FHL1在甲状腺瘤细胞中参与的细胞生物学功能,为后续研究FHL1基因介导甲状腺癌发生发展的分子机制提供依据。方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞系中大片段敲除FHL1基因,CCK-8实验测定B-CPAP^(FHL1-/-... 目的 探究FHL1在甲状腺瘤细胞中参与的细胞生物学功能,为后续研究FHL1基因介导甲状腺癌发生发展的分子机制提供依据。方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞系中大片段敲除FHL1基因,CCK-8实验测定B-CPAP^(FHL1-/-)细胞活率,细胞划痕实验计算B-CPAP^(FHL1-/-)细胞迁移率,抽提B-CPAP细胞和B-CPAP^(FHL1-/-)细胞RNA用于转录组高通量测序,并进行表达差异基因KEGG与GO富集分析。结果 实验结果显示B-CPAP细胞中FHL1基因缺失35 995 bp,导致蛋白功能被破坏。B-CPAP^(FHL1-/-)细胞与B-CPAP细胞相比增殖速率、迁移能力加快。B-CPAP与B-CPAP^(FHL1-/-)细胞转录组高通量测序分析结果表明,与B-CPAP细胞相比,B-CPAP^(FHL1-/-)细胞蛋白编码基因表达量分析检测到1 813个差异基因,其中1 125个基因上调,688个基因下调。KEGG通路富集分析发现细胞外基质受体交互作用、肿瘤信号通路、细胞黏附分子信号通路基因表达明显较高,这3条信号通路对肿瘤信号转导、侵袭及转移具有重要作用。对差异表达基因进行GO富集分析,发现上述3条信号通路的多种上调和下调表达基因。结论 B-CPAP^(FHL1-/-)细胞可能通过胞外基质受体交互作用、肿瘤信号通路、细胞黏附分子等信号通路上调相关基因表达,从而提升细胞增殖、迁移能力。 展开更多
关键词 甲状腺乳头状癌 FHL1 RNA-SEQ CRISPR/Cas9
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CRISPR/Cas9介导的KIFC1基因敲除对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响
3
作者 范晓静 魏雅岚 +2 位作者 叶洲杰 朱丽萍 王心睿 《肿瘤防治研究》 CAS 2023年第11期1051-1058,共8页
目的探讨KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法设计靶向KIFC1基因的sgRNAs并基于pSpCas9(BB)-2A-GFP载体构建重组质粒,共转染至He La细胞。通过流式细胞分选、有限稀释和测序验证筛选单克隆敲除细胞株。采... 目的探讨KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法设计靶向KIFC1基因的sgRNAs并基于pSpCas9(BB)-2A-GFP载体构建重组质粒,共转染至He La细胞。通过流式细胞分选、有限稀释和测序验证筛选单克隆敲除细胞株。采用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光法检测敲除细胞的KIFC1转录及蛋白表达水平,利用相差显微成像、荧光共聚焦显微成像观察细胞核、微管骨架等细胞表型。通过生长曲线绘制、EdU标记、吖啶橙染色分析细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡情况。结果KIFC1基因缺失导致He La细胞形态结构发生显著变化,多核、微核及异常微管骨架的细胞明显增加,细胞周期紊乱,细胞晚期凋亡数量显著升高,细胞增殖能力下降(均P<0.05)。结论KIFC1基因缺失影响He La细胞微管骨架的组装并形成异常延伸和细胞分裂,进而导致细胞核形态异常、染色质丢失、细胞周期停滞、凋亡增加。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 KIFC1 宫颈癌 He La细胞 细胞凋亡 细胞分裂
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CRISPR系统转化医学研究进展 被引量：3
4
作者 叶洲杰 王心睿 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期188-197,共10页
CRISPR系统作为在现今科学研究中对基因编辑运用广泛的一项技术,在后基因组学时代对于基因功能研究、疾病发生发展机制以及基因靶向药物等研究具有重要意义。目前人们运用CRISPR/Cas9编辑技术成功构建细胞和模式生物模型用于临床医学研... CRISPR系统作为在现今科学研究中对基因编辑运用广泛的一项技术,在后基因组学时代对于基因功能研究、疾病发生发展机制以及基因靶向药物等研究具有重要意义。目前人们运用CRISPR/Cas9编辑技术成功构建细胞和模式生物模型用于临床医学研究。CRISPR/Cas9作为一类强大的基因编辑技术不单只运用于基因功能缺失或外源基因敲入等研究中,CRISPR基因敲除文库筛选系统、CRISPR/dCas9基因激活系统、CRISPR干扰技术和CRISPR分子诊断技术等CRISPR转化医学研究将CRISPR应用于基因高通量筛选、基因沉默导致疾病发生、跨表观遗传修饰激活基因表达、可逆性干扰靶标基因表达以及运用CRISPR分子诊断检测病原微生物感染性疾病等临床研究中,推动生命科学和临床医学等多学科的发展。针对CRISPR系统在转化医学中的研究应用进行阐述。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 CRISPR诊断 CRISPR基因敲除文库 CRISPR激活系统 CRISPR干扰
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利用电转的方法对T细胞TET2基因敲除并探讨TET2对T细胞增殖的影响 被引量：2
5
作者 杨雷 叶洲杰 +2 位作者 李兆龙 沈阳坤 傅雅娟 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期229-237,共9页
近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视。然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用。与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率。TET(... 近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视。然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用。与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率。TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作为细胞中的DNA去甲基化酶,在细胞基因组表观遗传学中起着重要调控作用。研究表明TET2基因的缺失能够促进CAR-T细胞的快速繁殖,产生强力的CAR-T细胞。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对TET2基因进行敲除。首先对sgRNA进行体外转录,与大肠杆菌诱导表达的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP),并在体外酶切验证sgRNA的活性。接着利用电转染技术将Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)带入细胞内,并检测T细胞基因编辑效率。最后利用流式细胞分析技术检测T细胞的增殖情况。基因测序与T7EⅠ酶切结果表明,T细胞中的TET2基因被成功敲除,T细胞活力和功能并未受到影响。流式细胞技术,CCK-8以及台盼蓝细胞活率检测结果显示缺失Tet2蛋白后,T细胞的增殖速率明显快于野生型T细胞。该研究为非病毒载体替代传统的慢病毒载体构建携带嵌合抗原T细胞奠定了基础,具有制备周期短,安全性高的特点。同时TET2缺失促进了CAR-T细胞的增殖,使其能够引发有效的抗肿瘤反应,为CAR-T细胞免疫治疗提供了新的思路。 展开更多
关键词 Cas9核糖核蛋白(Cas9 RNP) TET2 电转染 基因敲除 T细胞增殖
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不同位置的滋养层细胞与内细胞团分子核型的关系
6
作者 李成龙 叶洲杰 杜生荣 《福建轻纺》 2021年第12期2-5,共4页
本研究分别活检废弃囊胚不同位置的滋养层细胞(Tropheetoderm cell,TE)及内细胞团(Inner cell mass,ICM),通过单细胞扩增技术和二代测序技术,比较不同位置的分子核型。结果表明,囊胚内细胞团细胞的分子核型与邻侧、对侧滋养层细胞的分... 本研究分别活检废弃囊胚不同位置的滋养层细胞(Tropheetoderm cell,TE)及内细胞团(Inner cell mass,ICM),通过单细胞扩增技术和二代测序技术,比较不同位置的分子核型。结果表明,囊胚内细胞团细胞的分子核型与邻侧、对侧滋养层细胞的分子核型存在差异,一致率分别为90%和86%,不同位置的滋养层细胞也存在差异性,滋养层细胞的分子核型不能完全代表内细胞团的分子核型。 展开更多
关键词 囊胚 滋养层细胞 内细胞团细胞 分子核型
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鼻咽癌Gli2基因敲除细胞株转录组学分析
7
作者 叶洲杰 王心睿 《中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生》 2023年第7期0095-0101,共7页
探究GLI2在鼻咽癌HNE-1细胞中参与的细胞生物学功能,为后续研究GLI2基因介导鼻咽癌发生发展的分子机制提供依据。方法 CRISPR/Cas9基因编辑技术在HNE-1细胞中敲除Gli2基因,细胞增殖与细胞周期检测HNE-1Gli2-/-细胞生物学功能改变情况,... 探究GLI2在鼻咽癌HNE-1细胞中参与的细胞生物学功能,为后续研究GLI2基因介导鼻咽癌发生发展的分子机制提供依据。方法 CRISPR/Cas9基因编辑技术在HNE-1细胞中敲除Gli2基因,细胞增殖与细胞周期检测HNE-1Gli2-/-细胞生物学功能改变情况,蛋白印迹检测CCND1、Bcl2、Bax等周期与凋亡相关蛋白表达,抽提HNE-1与HNE-1Gli2-/-细胞RNA进行转录组测序,分析差异性表达基因并且进行KEGG信号通路富集分析,挖掘显著性差异的信号通路,实时荧光定量PCR验证转录组测序准确性。结果 一代测序显示HNE-1细胞中Gli2基因发生移码突变,蛋白印迹无法检测正常蛋白条带。CCK-8结果显示HNE-1Gli2-/-细胞增殖速率显著低于野生型细胞(P<0.05),HNE-1Gli2-/-细胞周期阻滞。Gli2基因缺失导致Hedgehog信号下游CCND1等基因表达受抑制,并且Bax蛋白表达上调,促进细胞凋亡。转录组测序分析发现与野生型细胞相比HNE-1Gli2-/-细胞中有328个差异表达基因,其中上调基因204个,下调基因124个。KEGG差异信号通路分析在HNE-1与HNE-1Gli2-/-细胞中PI3K-AKT信号通路具有显著差异性,蛋白印迹显示HNE-1Gli2-/-细胞中p-AKT与mTOR蛋白表达显著降低(P<0.05),Gli2对于PI3K-AKT通路具有重要调控作用。结论:转录组测序分析HNE-1细胞Gli2基因缺失后PI3K-AKT通路具有显著差异性,p-AKT、mTOR蛋白表达量降低。该研究初步探索Gli2基因可能与PI3K-AKT通路具有交互作用从而调控HNE-1细胞的生命过程,为后续研究鼻咽癌发生发展提供新的分子依据。 展开更多
关键词 胶质瘤相关癌基因同源蛋白2基因 鼻咽癌 CRISPR/Cas9技术 转录组测序
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JQ-1联合小豆蔻明对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响 被引量：1
8
作者 朱丽萍 叶洲杰 王心睿 《中国临床药理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期809-813,共5页
目的探讨JQ-1与小豆蔻明(CAR)联用对乳腺癌细胞MCF-7增殖和细胞凋亡的影响。方法将MCF-7细胞实验分为空白组(不给药)、对照组(10.00μmol·L^(-1)CAR)、实验组(25.00μmol·L^(-1)JQ-1)及联合组(10.00μmol·L^(-1)CAR+25.0... 目的探讨JQ-1与小豆蔻明(CAR)联用对乳腺癌细胞MCF-7增殖和细胞凋亡的影响。方法将MCF-7细胞实验分为空白组(不给药)、对照组(10.00μmol·L^(-1)CAR)、实验组(25.00μmol·L^(-1)JQ-1)及联合组(10.00μmol·L^(-1)CAR+25.00μmol·L^(-1)JQ-1)。4组细胞均培养48 h。用CCK-8法检测细胞的增殖能力,用Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞的凋亡情况,用蛋白质印迹法检测磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和活化后胱天蛋白酶7(Cleaved Caspase7)的表达水平。结果联合组、实验组、对照组和空白组的增殖率分别为(47.79±11.27)%、(66.75±26.56)%、(74.57±13.59)%和(100.00±0)%,细胞晚期凋亡率分别为(24.17±1.27)%、(7.07±0.80)%、(14.70±3.12)%和(4.98±2.98)%,p-PI3K蛋白相对表达水平分别为0.87±0.02、1.11±0.06、1.09±0.03和1.00±0.00,p-AKT蛋白相对表达水平分别为0.31±0.05、0.96±0.06、0.96±0.16和1.00±0.00,Cleaved Caspase7蛋白相对表达水平分别为2.70±0.04、1.51±0.03、1.28±0.01和1.00±0.00。联合组的上述指标与空白组、对照组、实验组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论JQ-1与CAR联用对乳腺癌细胞MCF-7具有增强抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用,其作用机制可能与调控PI3K/AKT通路相关。 展开更多
关键词 小豆蔻明 JQ-1 乳腺癌 凋亡 协同作用
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组蛋白去甲基化酶KDM3B结构、功能及其相关疾病研究进展
9
作者 彭小燕 叶洲杰 王心睿 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2023年第3期364-373,共10页
表观遗传学是研究在DNA序列不变的前提下,其他机制异常引起基因表达改变并可遗传的学科。组蛋白甲基化/去甲基化修饰是表观遗传学的重要调控机制之一,是甲基化酶和去甲基化酶动态相互作用的结果,其中H3K9的甲基化和去甲基化是近年来研... 表观遗传学是研究在DNA序列不变的前提下,其他机制异常引起基因表达改变并可遗传的学科。组蛋白甲基化/去甲基化修饰是表观遗传学的重要调控机制之一,是甲基化酶和去甲基化酶动态相互作用的结果,其中H3K9的甲基化和去甲基化是近年来研究最深入的组蛋白修饰之一。组蛋白去甲基化酶KDM3B包含一个JmjC结构域,并具有固有的H3K9去甲基化活性,能够特异性去除H3K9me1/2甲基化修饰,调控基因转录、DNA损伤修复,参与细胞增殖、细胞凋亡、干细胞干性维持、肿瘤和遗传病发生发展等。该文就组蛋白去甲基化酶KDM3B的结构、作用机制、生物学功能及其成为一个临床研究和治疗的潜在药理学靶点的可能性作一综述。 展开更多
关键词 表观遗传 组蛋白去甲基化酶KDM3B 肿瘤 遗传病 生殖系统
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