文摘目的采用改进的Coca’s液提取户尘螨螨体中的蛋白,提高提取液的蛋白浓度和过敏原蛋白的效价。方法 (1)细胞破碎:取样品于研钵内,液氮反复冻融4次,每次间隔10min,在研钵内反复研磨冻融后的样品。(2)蛋白提取:在离心管中加入10ml Coca’s液,4℃匀速搅拌4 h后置于4℃冰箱过夜。(3)离心:4℃,5000×g离心1h,取上清液备用。(4)测提取蛋白的浓度:Bradford Reagent法测其提取蛋白的浓度。(5)SDS-PAGE电泳:参照Tricine-SDS-PAGE配制10%分离胶和4%浓缩胶,上样10μL。(6)采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行本研究获得的提取液与进口户尘螨过敏原蛋白产品的功能性比较。结果本研究中户尘螨过敏原蛋白提取液的蛋白浓度为3.0 mg/ml,远高于美国ALLERMED公司产品的0.35mg/ml;且电泳图显示包含分子量为25kDa、14kDa的户尘螨主要过敏原蛋白Der p 1、Der p 2条带,蛋白浓度也高于美国ALLERMED公司产品相应的条带;功能性实验中也表明本研究中户尘螨过敏原蛋白提取液的免疫效价也显著高于美国ALLERMED公司产品。结论可以用本研究的方法来大量提取户尘螨过敏原蛋白,提取液可替代进口产品,用作户尘螨过敏原检测试剂的生产原料或用于户尘螨过敏原皮试、点刺及脱敏治疗等,降低这些产品的生产成本,进而降低国内户尘螨过敏的诊疗费用。
