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山羊溶血性曼氏杆菌2型的分离鉴定 被引量：1
1
作者 刘晓波 毛首会 +8 位作者 李鹏飞 杜国玉 闫俊成 吴锦艳 刘萍 何继军 尚佑军 曹小安 王桂琴 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期485-490,共6页
为了确定某养殖场奶山羊细菌性感染导致死亡的具体病原种类,从送检的肺和肝组织病料中分离纯化细菌。通过生化培养特性观察、16S rRNA和毒力基因的PCR扩增、血清型鉴定、药敏试验和致病性试验来鉴定病原种类。结果显示,从送检的组织中... 为了确定某养殖场奶山羊细菌性感染导致死亡的具体病原种类,从送检的肺和肝组织病料中分离纯化细菌。通过生化培养特性观察、16S rRNA和毒力基因的PCR扩增、血清型鉴定、药敏试验和致病性试验来鉴定病原种类。结果显示,从送检的组织中分离出2株革兰阴性球杆菌;16S rRNA和毒力基因LKT测序结果表明,所分离的病原菌为溶血性曼氏杆菌,血清型鉴定均为溶血性曼氏杆菌A2型,故可确定分离株为具有致病性的溶血性曼氏杆菌2型。药敏试验结果显示,分离株对羧苄西林、庆大霉素敏感,对氨苄西林、卡那霉素等中度敏感,而对复方新诺明具有耐药性。小鼠致病性试验表明,接种分离株后小鼠于24 h内陆续死亡,并从剖检小鼠肺中也检测到溶血性曼氏杆菌,表明该菌有一定的致病力。结果表明,造成山羊死亡的主要病原是溶血性曼氏杆菌,这为溶血性曼氏杆菌病的临床用药提供了参考。 展开更多
关键词 山羊 溶血性曼氏杆菌 分离鉴定 药敏试验
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鉴别感染羊驼4种病毒多重PCR检测方法的建立
2
作者 于远光 岳涛 +9 位作者 马晓宁 张永兴 王萌 曾巧英 刘艳红 高闪电 独军政 吴锦艳 李坤 许小红 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1102-1107,共6页
为了建立一种用于羊驼易感的羊口疮病毒(ORFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)、口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)鉴别的多重PCR检测方法,根据GenBank中公布的ORFV、BVDV-1、FMDV和BTV参考株基因序列分别设计特异性引物,优化引物、dNTP、T... 为了建立一种用于羊驼易感的羊口疮病毒(ORFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)、口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)鉴别的多重PCR检测方法,根据GenBank中公布的ORFV、BVDV-1、FMDV和BTV参考株基因序列分别设计特异性引物,优化引物、dNTP、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度,通过敏感性和重复性检验,并对60份羊驼粪便样品和35份羊驼咽拭子样品进行验证。结果显示,所建立的多重PCR方法能够有效区分ORFV、BVDV-1、FMDV和BTV,最低检测限分别为3.18×10^(4)copies/μL、3.13×10^(1)copies/μL、3.06×10^(1)copies/μL、2.95×10^(2)copies/μL。结论:所建立的多重PCR方法能够同时快速鉴别羊驼感染的ORFV、BVDV-1、FMDV和BTV,具有较高的应用价值。 展开更多
关键词 羊驼 口蹄疫病毒 羊口疮病毒 蓝舌病病毒 牛病毒性腹泻病毒 多重PCR
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人兽共患羊传染性脓疱病疑似疫情的病原鉴定及其致病性分析
3
作者 裴旺胜 杜国玉 +6 位作者 张成 吴锦艳 王光祥 曹小安 张克山 张强 尚佑军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1073-1081,共9页
为确定呼和浩特市某规模化羊场发生的一起人兽共患羊口疮(orf)疑似疫情的病原,本研究从采自病羊和疑似感染人员的皮肤病损组织中成功分离到病毒,通过电镜观察、PCR和间接免疫荧光试验确诊为羊口疮病毒(ORFV)。对该分离株的B2L、ORFV121... 为确定呼和浩特市某规模化羊场发生的一起人兽共患羊口疮(orf)疑似疫情的病原,本研究从采自病羊和疑似感染人员的皮肤病损组织中成功分离到病毒,通过电镜观察、PCR和间接免疫荧光试验确诊为羊口疮病毒(ORFV)。对该分离株的B2L、ORFV121基因进行克隆测序,并与其他ORFV毒株进行遗传相关性分析,同时对采自1例病羊的样品进行病理组织学观察,最后采用兔体感染模型对此次人源分离株和羊源分离株的致病性进行分析。结果显示,本研究所涉规模羊场发生的人兽共患羊口疮疑似疫情确为orf田间野毒株引发,且感染致病力较强。患病羊除了嘴唇、口鼻部等处皮肤组织表现结痂、脓疱和花椰菜样等常见病症外,部分患病羊的外阴、乳房、蹄甲边缘皮肤组织出现增生、皲裂和结痂病变,且有些患病羊的消化道(如瘤胃、网胃)黏膜组织也出现溃疡和丘疹样病灶。测序分析显示,本研究中羊源、人源2个分离株的B2L和ORFV121基因不存在差异,表明它们来自于同一ORFV毒株的感染,且与疫苗株ORFV D1701的亲缘关系较近。兔体感染试验证实该毒株毒力较强(TCID_(50)为10^(5.0)/m L)。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 分离鉴定 遗传关系分析 病理剖检 病理组织学检查
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高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析 被引量：19
4
作者 吴锦艳 田宏 +9 位作者 尚佑军 刘湘涛 郑海学 靳野 尹双辉 满自萍 赵娜 蔡承茹 蔺芳 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期438-443,共6页
将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,... 将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明:该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。 展开更多
关键词 高致病性猪蓝耳病病毒 分离 鉴定 NSP2 特性分析
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国内部分地区羊支原体肺炎血清学调查及分析 被引量：35
5
作者 吴锦艳 尚佑军 +11 位作者 陈妍 王光祥 田宏 曹小安 尹双辉 樊天喜 臧金凤 栾志舫 王耀杰 王雪莹 刘湘涛 张志东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期156-158,共3页
为了解国内羊肺炎支原体的流行情况,本研究应用正向间接血凝试验(IHA)对2014年~2015年间采自我国12个省44个市、县的3 402份未免疫血清样品进行了绵羊肺炎支原体(MO)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)抗体的检测。结果显示:MO抗体阳性率为... 为了解国内羊肺炎支原体的流行情况,本研究应用正向间接血凝试验(IHA)对2014年~2015年间采自我国12个省44个市、县的3 402份未免疫血清样品进行了绵羊肺炎支原体(MO)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)抗体的检测。结果显示:MO抗体阳性率为31.92%(1 086/3 402),其中阳性率最高的省份为内蒙古76.8%(636/828),其次是河北50%(60/120)、吉林21.99%(93/423);Mccp的抗体阳性率为10.67%(363/3 402),其中阳性率最高省份为河南35.14%(39/111),其次为河北27.5%(33/120)、山东22.5%(27/120);另有来自河北、辽宁、吉林、海南、黑龙江、内蒙古和安徽7省份的少量血清样品同时检测出MO和Mccp两种抗体,表明该病的流行存在不同菌株混合感染的情况,这在河北地区最为严重(15%)。分析表明,羊支原体肺炎在我国大部分地区流行相当严重,尤其在河北、河南和山东等集约化舍饲养殖发展的地区。绵羊的抗体阳性率明显高于山羊,表明MO在致病性和感染性方面相对Mccp更强。本研究为评估羊支原体肺炎在我国的流行状况以及制定有效防制措施提供了实验依据。 展开更多
关键词 羊支原体肺炎 抗体水平 调查与分析
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猪生殖与呼吸综合征病毒HN／XT／07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析 被引量：11
6
作者 吴锦艳 田宏 +7 位作者 尚佑军 郑海学 靳野 尹双辉 赵娜 满自萍 刘湘涛 谢庆阁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1033-1037,共5页
从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,... 从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。 展开更多
关键词 猪生殖与呼吸综合征病毒 分离 鉴定 NSP2基因 特性分析
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猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析 被引量：18
7
作者 吴锦艳 田宏 +6 位作者 尚佑军 王光祥 靳野 尹双辉 陈研 何建辉 刘湘涛 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第10期5244-5247,共4页
[目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离... [目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。 展开更多
关键词 湖南湘潭 猪病 混合感染 鉴定 病原特性
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慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立 被引量：4
8
作者 吴锦艳 田宏 +6 位作者 蒙学莲 惠小婷 王耀杰 关玉华 尚佑军 刘永生 张志东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期218-226,共9页
利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定... 利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID_(50)·0.1mL^(-1)由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 SLAM Vero细胞系 GATEWAY技术 慢病毒表达系统
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猪口蹄疫病毒对三种动物细胞嗜性的研究 被引量：8
9
作者 吴锦艳 刘湘涛 +5 位作者 胡永浩 尚佑军 田宏 孙世琪 尹双辉 冯霞 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2005年第3期306-310,共5页
将猪FMDV毒株(O/GD/MSH/86)分别适应牛肾细胞(Bovinekidney,MD-BK)、幼仓鼠肾细胞(Babyhamsterkidney,BHK-21)和猪肾细胞(Porcinekidney,PK-15),研究了FMDV在宿主细胞上的嗜性。结果发现,该毒株在MD-BK细胞上不产生细胞病变(CPE),从细... 将猪FMDV毒株(O/GD/MSH/86)分别适应牛肾细胞(Bovinekidney,MD-BK)、幼仓鼠肾细胞(Babyhamsterkidney,BHK-21)和猪肾细胞(Porcinekidney,PK-15),研究了FMDV在宿主细胞上的嗜性。结果发现,该毒株在MD-BK细胞上不产生细胞病变(CPE),从细胞液中也未检测到病毒,而在BHK-21和PK-15细胞上能够稳定产生CPE。可见,猪FMDVO/GD/MSH/86毒株不能在MD-BK细胞上增殖,而在BHK-21和PK-15细胞上则增殖较好。 展开更多
关键词 猪 口蹄疫病毒 细胞 嗜性
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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达 被引量：2
10
作者 吴锦艳 田宏 +4 位作者 郑海学 陈妍 靳野 尚佑军 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期527-532,共6页
本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。 展开更多
关键词 T7RNA聚合酶基因 逆转录病毒载体 PK15细胞 SK6细胞 稳定表达
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慢病毒介导稳定表达抑制PRRSV复制的shRNA细胞系的建立 被引量：2
11
作者 吴锦艳 田宏 +4 位作者 尚佑军 陈妍 王光祥 刘湘涛 张志东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期2280-2287,共8页
利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pE... 利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6及pENTR/U6/-CON分别与pDEST载体进行LR重组,获得表达骨架,重组后的表达载体在转染试剂介导下与已经优化的辅助质粒Vira PowerTM Packaging Mix共转染293-FT包装细胞,获得慢病毒样粒子,并用其感染Marc-145细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR、CPE、TCID50、Real-time PCR和间接免疫荧光试验等方法分别验证上述细胞株的稳定整合以及其表达的shRNA对PRRSV增殖的抑制效果。结果显示:优势干扰序列和无关序列被稳定整合在靶细胞基因组上,无论观察细胞病变效应、免疫荧光产生情况、致细胞半数感染量还是实时定量分析相对表达量,与正常Marc-145和整合有无关序列的两株阴性对照细胞相比,整合有NSP9-4和NSP9-6的两株细胞由于表达了靶向抑制PRRSV复制的shRNA,PRRSV对其易感性降低,而且差别显著,分别将其命名为Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6。经验证,本研究成功构建两株稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA细胞——Marc/pU6/NSP9-4、Marc/pU6/NSP9-6,同时获得一株表达无意义shRNA的Marc/pU6-CON辅助细胞,该细胞表达的shRNA具有明显抑制PRRSV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因,也为PRRSV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等研究提供资料。 展开更多
关键词 PRRSV SHRNA Marc-145细胞系 慢病毒表达技术
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猪繁殖与呼吸综合征病毒一步多重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：2
12
作者 吴锦艳 田宏 +6 位作者 尚佑军 陈妍 魏衍全 侯相民 赵娜 何建辉 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1485-1490,共6页
本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一步多重RT-PCR检测方法。通过多序列比对以及反应条件的优化,从4对引物中精选了3对特异性和敏感性较好、扩增片段分别为228、345和490bp的引物,并应用所建立的方法对4种分离株的细胞毒... 本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一步多重RT-PCR检测方法。通过多序列比对以及反应条件的优化,从4对引物中精选了3对特异性和敏感性较好、扩增片段分别为228、345和490bp的引物,并应用所建立的方法对4种分离株的细胞毒和组织毒、田间样品及临床症状相似的疾病猪瘟和猪伪狂犬病毒做了检测;并对田间及实验室样品进行符合率试验,对阳性样品进行重复性试验。与常规RT-PCR法进行比较,证明该方法比常规RT-PCR法敏感性提高了10倍;而且利用该方法可使检测时间大大缩短;特异性试验证实该方法无交叉反应;阳性和阴性样本的符合率均为100%;3次阳性样品重复性检测结果完全相同;稳定性试验显示该试剂盒至少可保存1年以上。本研究所建立的PRRSV一步多重RT-PCR检测方法的敏感性高、特异性强、操作简便、省时、结果重复性好,不仅适用于临床病例尤其低微含量样品的诊断,而且在筛查隐形带毒动物及兽医检疫方面具有重要的应用价值。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 一步多重RT-PCR 检测方法
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猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析(英文) 被引量：2
13
作者 吴锦艳 田宏 +6 位作者 尚佑军 王光祥 靳野 尹双辉 陈研 何建辉 刘湘涛 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2010年第2期19-22,108,共5页
[目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离... [目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。CSFV和PCV2的鉴定:间接免疫荧光法操作。PRRSV的鉴定:由于PRRSV可致Marc-145细胞发生病变,故可由细胞病变与否作出初步鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。 展开更多
关键词 湖南湘潭 猪病 混合感染 鉴定 病原特性
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一起猪繁殖障碍与呼吸综合征和猪瘟混合感染的诊治 被引量：1
14
作者 吴锦艳 田宏 +2 位作者 吴慧珍 尚佑军 刘湘涛 《甘肃畜牧兽医》 2010年第1期29-29,共1页
关键词 猪繁殖障碍与呼吸道综合征 混合感染 呼吸综合征 猪瘟 诊治 实验室检测 临床诊断 发生情况
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稳定表达T7RNA聚合酶IBRS-2细胞系的建立以及利用该细胞系对SVDV的体内拯救 被引量：7
15
作者 郑海学 田宏 +4 位作者 靳野 吴锦艳 尚佑军 刘湘涛 谢庆阁 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第4期449-456,共8页
利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉... 利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉素进行传代筛选,形成细胞系IBRST7.对不同代次的IBRST7细胞基因组进行PCR和RT-PCR鉴定,结果表明,T7RNA聚合酶基因在细胞传代过程中能稳定存在,并能表达目的蛋白的mRNA.为了鉴定T7RNA聚合酶在IBRST7细胞内是否具有转录活性,扩增口蹄疫病毒(FMDV)的内部核糖体进入位点(IRES)片段和EGFP基因,定向克隆于原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了T7启动子控制下转录的具有非帽依赖性表达的重组质粒pIERS-EGFP-ET,把该质粒转染IBRST7细胞,能够在紫外显微镜下观察到绿色荧光,说明EGFP得到了表达,表明IBRST7细胞系内的T7RNA聚合酶具有转录活性.然后,利用该细胞系成功拯救出具有感染性的猪水泡病病毒(SVDV),并对其生物学功能进行了鉴定.该细胞系的建立为利用T7RNA聚合酶转录系统体内高效拯救病毒提供了基础.该拯救病毒的策略使RNA拯救简化为一步快速的拯救方法,为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础. 展开更多
关键词 T7RNA聚合酶 IBRST7细胞系 假型病毒 SVDV 病毒拯救 逆转录病毒载体 感染性克隆
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猪瘟病毒及其致病机制研究进展 被引量：19
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作者 田宏 刘湘涛 +3 位作者 张彦明 林彤 吴锦艳 谢庆阁 《动物医学进展》 CSCD 2007年第B08期27-30,共4页
猪瘟(CSF)是猪的一种高度接触性传染病,该传染病可分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF由强毒株引发,一般导致高发病率和死亡率,而弱毒病毒感染则表现不明显。由于疫苗的广泛应用,有效地控制了猪瘟的大流行,减少了急... 猪瘟(CSF)是猪的一种高度接触性传染病,该传染病可分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF由强毒株引发,一般导致高发病率和死亡率,而弱毒病毒感染则表现不明显。由于疫苗的广泛应用,有效地控制了猪瘟的大流行,减少了急性死亡。但从20世纪80年代以后,临床症状不典型且病程变长的非典型性猪瘟(或慢性猪瘟)成为该病的主要发生形式,持续感染普遍存在,疫苗的预防效果明显下降,使猪瘟防制遇到了新的困难。以目前人类对猪瘟的认识水平,尚难以从分子水平解释这一新变化的成因,这是因为对猪瘟病毒致病机理及其分子基础的认识深度不够。就此,文章综述了猪瘟及猪瘟病毒研究进展,主要涉及CSFV生物学特性、致病机制及其防控,希望能为猪瘟防控提供新的思路和对策。 展开更多
关键词 猪瘟 猪瘟病毒 致病机制 疫苗
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建 被引量：8
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作者 赵娜 田宏 +4 位作者 吴锦艳 满自萍 尚佑军 何生虎 刘湘涛 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2009年第1期83-86,共4页
根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5... 根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因 克隆 杆状病毒表达
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猪瘟病毒及其全长cDNA在猪肾细胞中增殖表达特性的比较研究 被引量：5
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作者 田宏 张彦明 +5 位作者 林彤 刘湘涛 胡建和 吴锦艳 张淼涛 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1038-1042,共5页
以猪瘟C-株弱毒疫苗株、经典强毒石门株和C-株全长cDNA为试验材料,以免疫荧光技术为主;结合ELISA和RT-PCR检测技术,对其在培养细胞中的增殖特性和表达规律进行了比较研究。同时筛选猪瘟病毒及其全长cDNA的敏感细胞,探索其增殖表达规律,... 以猪瘟C-株弱毒疫苗株、经典强毒石门株和C-株全长cDNA为试验材料,以免疫荧光技术为主;结合ELISA和RT-PCR检测技术,对其在培养细胞中的增殖特性和表达规律进行了比较研究。同时筛选猪瘟病毒及其全长cDNA的敏感细胞,探索其增殖表达规律,以便为猪瘟病毒反向遗传操作提供技术方法和可操作的条件。 展开更多
关键词 猪瘟病毒C-株 石门株 全长cDNA细胞转染 细胞转染鉴定
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PRRSV兰州分离株ORF3和ORF5基因的克隆与序列分析及其杆状病毒表达载体的构建 被引量：4
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作者 赵娜 田宏 +5 位作者 吴锦艳 祁燕蓉 满自萍 尚佑军 何生虎 刘湘涛 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期189-195,共7页
根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中国代表株CH-1a的基因组序列，设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物，利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株（Lanzhou株）的ORF3和ORF5基因，并对其进行序列测定，同时与已发表的1... 根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中国代表株CH-1a的基因组序列，设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物，利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株（Lanzhou株）的ORF3和ORF5基因，并对其进行序列测定，同时与已发表的13株PRRSV进行同源性比较。将扩增的PRRSV Lanzhou株ORF3、ORF5基因分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTA上，将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒pFastBacHTA-ORF3、pFastBacHTA-ORF5分别转化到DH10Bac感受态细胞。结果显示，ORF3、ORF5基因长度分别为765bp、603bp，发现核苷酸的同源性分别为88.0％—99.2％、87.3％—99.0％，获得了重组转座子rBacmid-ORF3、rBacmid-ORF5。 展开更多
关键词 猪生殖与呼吸综合征病毒 ORF3基因 ORF5基因 克隆 杆状病毒表达载体
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重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性 被引量：5
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作者 田宏 刘湘涛 +8 位作者 林彤 吴锦艳 龚真莉 郑海学 代兴国 孙世琪 尚佑军 谢庆阁 张彦明 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期460-463,共4页
从实验感染兔脾组织中提取总RNA,应用RT-PCR得到了CSFV C-株结构蛋白E2基因,定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro,经PCR、酶切和序列分析鉴定,获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒... 从实验感染兔脾组织中提取总RNA,应用RT-PCR得到了CSFV C-株结构蛋白E2基因,定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro,经PCR、酶切和序列分析鉴定,获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,并在Polybrene的介导下感染PK15细胞,嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明,所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因,而且表达产物具有良好的生物学活性。 展开更多
关键词 猪瘟C株E2基因 重组逆转录病毒载体 PK15细胞 基因表达
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