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基于CRISPR/Cas9技术构建PAX3-FOXO1融合基因敲除腺泡状横纹肌肉瘤细胞模型
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作者 张乾儒 田娇 +4 位作者 孟莲 史奇 李亚 夏慧欣 李锋 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第5期621-630,共10页
目的使用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除PAX3-FOXO1融合基因的人腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)细胞系(RH30),并验证PAX3-FOXO1功能。方法运用在线网站针对PAX3、FOXO1设计sgRNA,选择切割效率最高的一组构建LV-PAX3-sgRNA、LV-FOXO1-sgRNA及LV-C... 目的使用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除PAX3-FOXO1融合基因的人腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)细胞系(RH30),并验证PAX3-FOXO1功能。方法运用在线网站针对PAX3、FOXO1设计sgRNA,选择切割效率最高的一组构建LV-PAX3-sgRNA、LV-FOXO1-sgRNA及LV-Cas9慢病毒载体;LV-Cas9病毒感染RH30细胞,潮霉素筛选后,通过RT-PCR及qRT-PCR检测RH30-Cas9细胞中Cas9基因表达;LV-PAX3-sgRNA及LV-FOXO1-sgRNA慢病毒载体分别感染RH30-Cas9细胞,流式分选筛选荧光阳性细胞;Sanger测序、PCR等分别验证RH30-PAX3-KO细胞及RH30-FOXO1-KO细胞中PAX3-FOXO1表达;EDU、TUNEL、Transwell实验检测敲除RH30-PAX3-KO细胞及RH30-FOXO1-KO细胞功能改变。结果成功构建靶向PAX3、FOXO1的CRISPR/Cas9慢病毒载体;PCR验证稳定表达Cas9的RH30细胞系(RH30-Cas9)构建成功;PCR、Western Blot验证靶向PAX3或FOXO1均成功敲除RH30中PAX3-FOXO1融合基因;靶向PAX3或FOXO1抑制RH30细胞增殖、侵袭、迁移,促进凋亡。结论使用CRISPR/Cas9成功构建敲除PAX3-FOXO1的RH30细胞系;敲除PAX3-FOXO1抑制了RH30细胞增殖、迁移等恶性生物学行为。 展开更多
关键词 横纹肌肉瘤 PAX3-FOXO1 CRISPR/Cas9 基因编辑
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