B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立 被引量：1

1

作者 孙伟洋 于志君 +11 位作者 李雪 陈强 高晓龙 国娇 张坤 李元果 王铁成 杨松涛 黄耕 赵永坤 高玉伟 夏咸柱 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期35-39,共5页

目的利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定... 目的利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以105EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果成功从体外拯救出B型流感病毒B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性;攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论成功搭建B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究比较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。 展开更多

关键词 B型流感病毒 反向遗传操作 致病性 BALB/C小鼠

下载PDF 职称材料

中国首株H13N6亚型禽流感病毒遗传进化分析及致病性和传播性评估 被引量：3

2

作者 高晓龙 范胜涛 +12 位作者 李胜楠 国娇 王爱荣 孙伟洋 李雪 虞一聪 王铁成 李元果 桑晓宇 于志君 张坤 高玉伟 夏咸柱 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期172-176,共5页

为了解我国首次分离的H13N6亚型禽流感病毒(AIV)生物学特性,本研究对该分离株进行全基因序列测定和分析,并对其进行BALB/c小鼠和SPF鸡致病性试验以及豚鼠传播试验。序列分析表明HA碱性裂解位点序列为PAISNR↓G,为低致病性AIV。遗传进化... 为了解我国首次分离的H13N6亚型禽流感病毒(AIV)生物学特性,本研究对该分离株进行全基因序列测定和分析,并对其进行BALB/c小鼠和SPF鸡致病性试验以及豚鼠传播试验。序列分析表明HA碱性裂解位点序列为PAISNR↓G,为低致病性AIV。遗传进化分析表明NA基因属于北美谱系,其余7个基因均属于欧亚谱系;其中NA、NP、M、NS基因来源于鸥类,而HA、PB2、PB1、PA基因来源于野鸭类。动物致病性和传播试验结果显示,该病毒株在鸡和小鼠体内不能进行有效复制,在豚鼠和鸡体内也不能进行排毒和有效传播。基因序列分析结合致病性和传播性试验表明H13N6亚型AIV分离株可能是通过候鸟迁徙而传入我国的新型重组AIV,但该病毒株仍只能感染野生水禽尚未获得跨越种间屏障感染陆生家禽和人的能力,尚不具备哺乳动物间和家禽间的传播能力。 展开更多

关键词 H13N6 传播 致病力 鸡 小鼠 豚鼠

下载PDF 职称材料

流感病毒动物感染模型及其应用 被引量：6

3

作者 于志君 孙伟洋 +5 位作者 张醒海 杨松涛 王铁成 赵永坤 高玉伟 夏咸柱 《传染病信息》 2016年第3期133-138,共6页

流感病毒动物感染模型是研究流感病毒致病性、传播性和宿主抗病毒免疫机制的基础。目前已有多种动物用于流感病毒研究,主要包括小鼠、雪貂和猕猴等。本文介绍了目前已经建立的流感病毒动物感染模型及其应用,为流感病毒的防控工作提供借鉴。

关键词 流感病毒 模型 动物 感染

下载PDF 职称材料

几种抗病毒药物对甲型H1N1季节性流感病毒的体内外抑制效果评价 被引量：2

4

作者 方树珊 李元果 +11 位作者 夏青 张亚敏 张醒海 赵梦琳 何健 孙伟洋 王铁成 冯娜 夏咸柱 郭振东 岳冬辉 高玉伟 《中医药临床杂志》 2019年第4期599-605,共7页

目的:评价流感病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦及几种中药单体化合物对2018年河北流行株H1N1体内外抑制效果的评价。方法:通过鸡胚及MDCK细胞系扩增培养河北株甲型H1N1季节性流感病毒(简称BH076)。对所获毒株进行基因突变分析未发现毒株... 目的:评价流感病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦及几种中药单体化合物对2018年河北流行株H1N1体内外抑制效果的评价。方法:通过鸡胚及MDCK细胞系扩增培养河北株甲型H1N1季节性流感病毒(简称BH076)。对所获毒株进行基因突变分析未发现毒株具有耐奥司他韦H275Y位点及其他相关位点突变。通过细胞水平和小鼠体内分组治疗评价奥司他韦对BH076株的抑制作用。结果:奥司他韦无论在细胞水平还是小鼠体内均无抑制作用。通过直接作用和间接作用两种方法评价茶黄素、芦丁、金丝桃苷、羟基红花黄色素A在细胞水平上对BH076株的抑制作用,发现茶黄素在药物浓度达0.125mg/ml以上时对H1N1流感病毒有抑制作用,芦丁可在浓度为2 mg/m:以上时具有抑制病毒的作用。结论:该毒株对奥司他韦抑制的敏感性降低且中药单体化合物茶黄素对该毒株有较好的抑制作用。 展开更多

关键词 流感病毒 奥司他韦 耐药性 中药单体化合物

下载PDF 职称材料

B型流感疫苗候选株在MDCK悬浮细胞上培养工艺优化研究

5

作者 武毓姝 孙伟洋 +9 位作者 赵梦琳 夏叶婷 冯越 罗敏 任娟 高鸿博 王铁成 夏咸柱 高玉伟 闫芳 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期283-292,共10页

为了大规模生产重组B型流感疫苗候选株rIBV,本研究探索了rIBV在无血清MDCKs细胞上的最佳培养条件,再扩大到生物反应器中优化工艺参数,经过连续传代15代后测定了MDCKs细胞源毒种rIBV的遗传稳定性和病毒滴度。通过对病毒培养条件进行优化... 为了大规模生产重组B型流感疫苗候选株rIBV,本研究探索了rIBV在无血清MDCKs细胞上的最佳培养条件,再扩大到生物反应器中优化工艺参数,经过连续传代15代后测定了MDCKs细胞源毒种rIBV的遗传稳定性和病毒滴度。通过对病毒培养条件进行优化,我们确定了rIBV在MDCKs细胞上增殖的最佳培养条件是TOI为72h、MOI=0.001、CCI为4.0×10^(6)细胞、TPCK胰酶浓度为2μg/m L、50%DO和pH=7.2±0.5。rIBV在MDCKs细胞上连续传代15代后仍然具有高度遗传稳定性。相比于鸡胚源rIBV株,适应MDCKs细胞生长15代后rIBV株的EID_(50)由10^(6.25)/mL提高至10^(9.5)/mL,TCID_(50)由10^(4.5)/mL提高至10^(8.25)/mL。本研究对重组B型流感疫苗候选株r IBV在MDCKs细胞上的培养工艺进行了优化,获得一株具有高感染力和高病毒滴度的MDCKs细胞源疫苗候选株r IBV,为下游流感疫苗生产及纯化工艺奠定了基础。 展开更多

关键词 流感病毒 MDCKs细胞 悬浮培养 生物反应器 工艺优化

原文传递

犬流感研究新进展 被引量：8

6

作者 于志君 张醒海 +6 位作者 张坤 孙伟洋 王铁成 杨松涛 黄耕 高玉伟 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第8期768-768,I0001-I0003,共4页

目前已发现多种亚型流感病毒可感染犬,包括H1、H3、H5和H9亚型。其中H3N8和H3N2亚型流感病毒可在犬群中流行,主要引起呼吸道症状。犬流感出现不仅威胁犬的健康,也给公共卫生带来了威胁。本文从生态学特征、病原性、诊断及预防控制等方... 目前已发现多种亚型流感病毒可感染犬,包括H1、H3、H5和H9亚型。其中H3N8和H3N2亚型流感病毒可在犬群中流行,主要引起呼吸道症状。犬流感出现不仅威胁犬的健康,也给公共卫生带来了威胁。本文从生态学特征、病原性、诊断及预防控制等方面对犬流感的最新研究进展进行了综述。 展开更多

关键词 犬流感 H3N2 H3N8 H9N2 综述

原文传递

A型流感病毒通用型人源化抗体的构建及初步鉴定 被引量：5

7

作者 王铁成 任志广 +19 位作者 桑晓宇 于志君 张坤 高晓龙 孙伟洋 李元果 郑学星 高玉竹 耿海东 徐钰 解林红 吴长江 张晓田 孙贺廷 初冬 赵永坤 杨松涛 王化磊 高玉伟 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2014年第6期481-485,560,共6页

目的制备A型流感病毒通用型人源化抗体并进行鉴定。方法通过文献检索、蛋白质序列数据库(Swissprot)、蛋白质结构数据库(PBD)等获得抗流感抗体的序列信息,经计算机分析软件InsightⅡ分析抗体结构,采用分子模拟、分子对接等方法分析抗体... 目的制备A型流感病毒通用型人源化抗体并进行鉴定。方法通过文献检索、蛋白质序列数据库(Swissprot)、蛋白质结构数据库(PBD)等获得抗流感抗体的序列信息,经计算机分析软件InsightⅡ分析抗体结构,采用分子模拟、分子对接等方法分析抗体的轻、重链可变区基因结构,用昆虫细胞偏嗜密码子优化氨基酸序列,合成抗流感病毒抗体轻、重链可变区基因;对合成氨基酸序列中的轻、重链可变区基因作酶切鉴定,将轻链可变区基因与杆状病毒表达载体PAC-κ-CH3连接,构建PAC-κ-L-CH3,酶切合成的重链可变区基因与PAC-κ-L-CH3连接,构建PAC-κ-L-H-CH3重组表达载体,鉴定正确后,同杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞(sf9)中,于27℃用无血清培养基培养,收集上清,应用各亚型流感病毒株灭活后进行血凝抑制试验和ELISA试验,检测制备的抗体对流感病毒的通用性;通过荧光抗体试验检测抗体在细胞中的表达。结果重组杆状病毒表达载体转染sf细胞后,传代上清中检测到抗体;血凝抑制试效价为1︰2;ELISA结果显示有3株制备的抗体对3种流感病毒呈阳性反应,1株对实验用的流感病毒株没有反应;转染后传代细胞的荧光抗体鉴定结果显示有阳性抗体表达。结论成功采用计算机筛选合成抗流感病毒抗体基因,初步获得A型流感病毒通用型抗体。 展开更多

关键词 人源化抗体 流感病毒 可变区 PAC—rcH3

原文传递

B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响分析 被引量：2

8

作者 李雪 于志君 +7 位作者 孙伟洋 陈强 王铁成 杨松涛 黄耕 高玉伟 夏咸柱 张雪梅 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期404-409,共6页

本研究利用基因工程技术探索B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响,并利用反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端缺失的B型流感病毒,评估去除NS1蛋白羧基端对B型流感病毒致病性的影响,探究B型流感病毒致病性变异的分子基础... 本研究利用基因工程技术探索B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响,并利用反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端缺失的B型流感病毒,评估去除NS1蛋白羧基端对B型流感病毒致病性的影响,探究B型流感病毒致病性变异的分子基础。通过全基因合成和反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端发生171个氨基酸缺失的B型流感病毒B/Yamagata/16/88株,命名为B-L5。将实验室之前拯救的母本株B/Yamagata/16/88(以下简称B-S9)和B-L5以3×105 EID5 0的攻毒剂量分别人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒滴度等方面进行致病性分析。成功构建了B型流感病毒B/Yamagata/16/88NS1蛋白羧基端缺失株反向遗传平台。母本株B-S9和NS1蛋白羧基端缺失株B-L5均能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠均呈现低致病性;B-S9感染小鼠后,从攻毒后第3d至第7d,体重持续下降,相反,B-L5感染小鼠后,只在攻毒后第2d出现体重下降,攻毒后第3d体重开始回升;B-S9和B-L5感染小鼠后均能在小鼠肺部进行复制,但攻毒后第3d,B-L5感染小鼠肺脏滴度要比B-S9低7 900倍,攻毒后第6d,B-L5感染小鼠肺脏已检测不到病毒复制。实验结果表明,NS1蛋白羧基端缺失可以明显降低B型流感病毒对小鼠的致病性。B型流感病毒致病性变异的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统的建立为B型流感病毒分子机制的研究奠定了基础,同时也为B型流感减毒活疫苗的研究开辟了新途径。 展开更多

关键词 B型流感病毒 反向遗传操作 致病性 NS1蛋白

原文传递

马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白的制备及其治疗效果评价 被引量：2

9

作者 赵永坤 张国利 +12 位作者 褚迪 王承宇 罗琴芳 王化磊 田园 孙伟洋 王铁成 高玉伟 万忠海 黄耕 冯娜 杨松涛 夏咸柱 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第5期490-493,共4页

目的制备马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白,并评价其对BALB/c小鼠的治疗效果。方法应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统分别构建的表达H7N9亚型流感病毒HA、NA及M1蛋白的病毒样颗粒制备抗原,免疫健康马匹,当抗体效价达1∶10 000以上时,采... 目的制备马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白,并评价其对BALB/c小鼠的治疗效果。方法应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统分别构建的表达H7N9亚型流感病毒HA、NA及M1蛋白的病毒样颗粒制备抗原,免疫健康马匹,当抗体效价达1∶10 000以上时,采血,对血清进行粗处理;采用亲和层析的方法获得纯化的马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2。对纯化的免疫球蛋白进行蛋白含量测定和质量检测。用H7N9亚型流感病毒BALB/c小鼠感染模型评价F(ab’)_2的治疗效果。结果免疫马匹血清中产生高滴度的中和抗体,获得的纯化马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2中和抗体效价达1∶5 120,质量检测合格。攻毒4 h后给药0.4和0.2 mg,小鼠存活率均达100%。结论获得了安全、高效的马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白F(ab’)_2,为人禽流感治疗用制剂的研发提供了参考。 展开更多

关键词 H7N9亚型流感病毒 免疫球蛋白 疗效

原文传递

通用H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备 被引量：1

10

作者 刘静 任志广 +6 位作者 王铁成 李元果 孙伟洋 冯娜 秦川 高玉伟 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第7期755-760,共6页

目的高致病性H5N1亚型流感病毒可感染人,并不断衍生出多个新的基因谱系,存在着大规模流行的可能性。我国现有的商品化疫苗无法对不同谱系的H5N1流感病毒感染提供有效的保护。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗具有良好的免疫... 目的高致病性H5N1亚型流感病毒可感染人,并不断衍生出多个新的基因谱系,存在着大规模流行的可能性。我国现有的商品化疫苗无法对不同谱系的H5N1流感病毒感染提供有效的保护。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗具有良好的免疫原性和安全性,成为近年研究的热点。本研究旨在建立H5亚型禽流感病毒通用型病毒样颗粒疫苗的制备方法。 方法将优化的H5N1A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade 2.3.2.1)亚型流感病毒的HLHA(HA stem)/5M2e(5个M2e)/HL5M2e(5M2e替代HA的头部嵌入HLHA)、NP基因和M1基因分别插入pFast-BacDual载体,得到相应的重组供体。然后将重组供体转化至含Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,获得含有目的基因的重组杆粒。 结果酶切和PCR鉴定表明成功构建了含目的基因的重组杆粒Bacmid-(HLHA/5M2e/HL5M2e、NP、M1)。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,IFA试验和Western blot试验皆证实,优化的HLHA(HA stem)/5M2e/HL5M2e、NP基因和M1基因编码的蛋白均获得表达。透射电子显微镜观察VLPs转染Sf9细胞上清的浓缩液中,有球形结构和100nm左右典型VLPs存在。 结论在Sf9昆虫杆状病毒表达系统中成功表达H5N1A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade 2.3.2.1)亚型禽流感病毒的HLHA(HA stem)/5M2e/HL5M2e、NP和M1蛋白,并组装成3种VLPs,为进一步研究流感病毒的VLPs疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 流感病毒 基因优化 HLHA(HA stem)/5M2e/HL5M2e NP M1 病毒样颗粒

原文传递

应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在蚕蛹中表达狂犬病病毒糖蛋白

11

作者 赵丽丽 孙伟洋 +8 位作者 冯昊 胡桂秋 李岭 李露 郭鹤 赵平森 王化磊 杨松涛 夏咸柱 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第7期797-800,804,共5页

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在蚕蛹中高效表达狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)糖(G)蛋白。方法从狂犬病病毒CVS-11株总RNA中扩增G基因片段,插入供体质粒pFastBacⅠ-G中,构建重组供体质粒pFastBacⅠ-G,转化大肠杆菌DH10Bac,构建... 目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在蚕蛹中高效表达狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)糖(G)蛋白。方法从狂犬病病毒CVS-11株总RNA中扩增G基因片段,插入供体质粒pFastBacⅠ-G中,构建重组供体质粒pFastBacⅠ-G,转化大肠杆菌DH10Bac,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-G,将其转染BmN细胞,获得含G基因的重组杆状病毒。将重组病毒感染蚕蛹,收集血淋巴,进行Western blot分析。结果重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-G经PCR鉴定证明构建正确;狂犬病病毒糖蛋白在重组杆状病毒感染的BmN细胞中和蚕蛹中获得正确表达,在蚕蛹中表达的重组蛋白可与His标记的单克隆抗体和狂犬病病毒阳性血清特异性结合。结论成功构建了重组狂犬病病毒糖蛋白杆状病毒,并在蚕蛹中获得了表达,表达产物具有良好的抗原性。 展开更多

关键词 杆状病毒表达系统 狂犬病病毒 糖蛋白 蚕蛹

原文传递

H1N1嵌合冷适应疫苗株的构建及其生物学特性分析与鉴定

12

作者 李东旭 孙伟洋 +12 位作者 赵梦琳 孙悦 朱梦涵 刘夏薇 苏日娜 武毓姝 任娟 罗敏 王铁成 冯娜 夏咸柱 高玉伟 闫芳 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第5期497-501,507,共6页

目的应用反向遗传技术构建以B型流感病毒冷适应株为骨架表达季节性流感病毒H1N1 HA蛋白的嵌合疫苗株。方法将B型流感病毒冷适应株B/Vienna/1/99的HA片段胞外区替换为H1N1(A/Victoria/2570/2019)的HA蛋白,将重组质粒与骨架株的其余7个质... 目的应用反向遗传技术构建以B型流感病毒冷适应株为骨架表达季节性流感病毒H1N1 HA蛋白的嵌合疫苗株。方法将B型流感病毒冷适应株B/Vienna/1/99的HA片段胞外区替换为H1N1(A/Victoria/2570/2019)的HA蛋白,将重组质粒与骨架株的其余7个质粒共转染293T细胞,拯救H1N1嵌合疫苗株。对重组病毒株进行血凝鉴定、RT-PCR鉴定、电镜鉴定、一步生长曲线绘制以及小鼠安全性评价。结果成功拯救出H1N1嵌合流感病毒株,命名为rA/B-H1-Vic。经测序鉴定其序列与预期一致,并且在电镜下观察到流感病毒粒子的典型特征。H1N1嵌合流感病毒株血凝效价最高达2^(5),在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(4.5) TCID_(50)/mL,在鸡胚中的病毒滴度为10^(8.36)EID_(50)/mL。分别以10^(6) EID_(50)和10^(5) EID_(50)剂量鼻腔接种小鼠,其体重与对照组相比无明显下降,小鼠存活率100%,攻毒后第3 d仅在小鼠鼻甲骨和肺脏组织检测到低水平的病毒复制。结论成功拯救出无毒力的H1N1嵌合疫苗株,为流感病毒新型疫苗的研制提供了新的思路。 展开更多

关键词 H1N1嵌合疫苗株 HA 嵌合疫苗 反向遗传技术

原文传递

我国野鸟新城疫病毒流行调查及遗传进化分析

13

作者 王文浩 于明远 +13 位作者 李元果 梁宏蕊 胡鑫宇 李敏 李方旭 赵艳斌 宋丹丹 陈艳艳 孔云逸 王铁成 孙伟洋 高玉伟 解林红 王磊 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第3期249-253,259,共6页

目的掌握我国野鸟中新城疫病毒(NDV)的流行及遗传进化特征。方法结合候鸟的分布、迁徙规律以及栖息环境等信息,在途经中国的东亚-澳大利亚和西太平洋候鸟迁徙路线及其他重要野鸟栖息、停歇地作为监测哨点,采集环境样品、组织及咽肛拭子... 目的掌握我国野鸟中新城疫病毒(NDV)的流行及遗传进化特征。方法结合候鸟的分布、迁徙规律以及栖息环境等信息,在途经中国的东亚-澳大利亚和西太平洋候鸟迁徙路线及其他重要野鸟栖息、停歇地作为监测哨点,采集环境样品、组织及咽肛拭子等样品进行NDV鉴定,阳性样品按照地域、物种和采集时间划分挑取代表株并进行F基因序列测定,构建NJ进化树并分析F蛋白裂解位点。结果2013-2021年共采集环境样品、拭子及组织样品113017份,分离获得67株候鸟NDV,均来自常规监测中采集的拭子和环境样品,死亡野鸟中未检出NDV。历年野鸟中NDV的分离率分别为:2013年0.21%,2014年0.23%,2015年0.04%,2016年0.05%,2017年0.03%,2018年0.03%,2020年0.06%,2021年0.01%。F基因遗传进化分析表明,26株代表株中有20株NDV为ClassⅠ(14株genotypeⅠ.1.1.2,6株genotypeⅠ.1.2),宿主分布为苍鹭、赤麻鸭、斑嘴鸭、红腹滨鹬、海鸬鹚及鸥类;6株NDV为ClassⅡ(1株为genotypeⅠ.1.1,1株为genotypeⅠ.1.2.1,4株为genotypeⅠ.2),宿主分布为豆雁、翘嘴鹬、绿头鸭、红头潜鸭。经F蛋白裂解位点分析,26株新城疫病毒代表株均符合弱毒株分子特征。结论新城疫病毒野鸟宿主种类呈多样性,且同时存在ClassⅠ和ClassⅡ两类新城疫弱毒株。可为我国野鸟中新城疫病毒的流行、进化和宿主多样性提供数据资料。 展开更多

关键词 新城疫病毒 野鸟 多样性 遗传进化分析

原文传递

SARS-CoV-2细菌样颗粒对小鼠的免疫原性及攻毒保护效果评价

14

作者 苏日娜 石壮壮 +7 位作者 任娟 罗敏 王铁成 冯娜 王建忠 夏咸柱 孙伟洋 高玉伟 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第7期745-749,758,共6页

目的本研究以C57BL/6N小鼠为模型,评价SARS-CoV-2细菌样颗粒(Bacterium-Like Particles,BLPs)的免疫原性和攻毒保护效果,为新型冠状病毒感染(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)疫苗研发提供新思路。方法使用SARS-CoV-2细菌样颗粒Trim... 目的本研究以C57BL/6N小鼠为模型,评价SARS-CoV-2细菌样颗粒(Bacterium-Like Particles,BLPs)的免疫原性和攻毒保护效果,为新型冠状病毒感染(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)疫苗研发提供新思路。方法使用SARS-CoV-2细菌样颗粒Trim-RBD-GEM分别在第0、21 d滴鼻免疫C57BL/6N小鼠,在第7、14、21、28、35 d采小鼠血,分离血清,采用ELISA检测特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。在免疫后第35 d使用50 LD50的C57MA14毒株对C57BL/6N小鼠进行攻毒,记录攻毒后14 d内小鼠体重变化及存活情况;在攻毒后第3 d取小鼠的鼻甲骨和肺脏组织,测定鼻甲骨和肺脏组织中的病毒滴度和病毒载量。另取肺脏组织,使用4%多聚甲醛固定后制作病理切片并染色,观察肺脏组织病理变化,免疫组化法检测病毒蛋白的表达。结果Trim-RBD-GEM滴鼻免疫小鼠后诱导产生特异性抗体,IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均显著升高。从攻毒后第1 d开始Trim-RBD-GEM组小鼠体重出现下降,第4 d体重逐步回升,观察期小鼠均存活,存活率为100%;Mock组小鼠在攻毒后第7 d体重均下降至75%以下,且所有小鼠均死亡,存活率为0。攻毒后Trim-RBD-GEM组小鼠肺脏组织中病毒滴度显著低于mock组(P<0.05)。攻毒后第3 d取各组小鼠肺脏做组织病理学检查,Trim-RBD-GEM组小鼠局部支气管管腔内可见少量巨噬细胞浸润,mock组小鼠肺脏切片中多处支气管管腔内可见坏死细胞碎片;免疫组化试验显示mock组小鼠肺脏切片检测到SARS-CoV-2的N蛋白。结论Trim-RBD-GEM滴鼻免疫小鼠可诱导产生特异性IgG抗体,可为COVID-19疫苗的研发提供参考。 展开更多

关键词 SARS-CoV-2细菌样颗粒 C57BL/6N小鼠 滴鼻免疫 免疫原性 攻毒保护

原文传递

重组H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)的表达及鉴定 被引量：3

15

作者 孟令楠 任志广 +14 位作者 冀显亮 李元果 李胜楠 于志君 孙伟洋 国娇 赵永坤 王铁成 冯娜 王化磊 杨松涛 高玉伟 胡桂学 夏咸柱 YU Jing-jie 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2016年第5期401-404,410,共5页

目的为了获得H7N9HA蛋白,利用昆虫杆状病毒表达系统表达了H7N9HA基因并获得重组H7N9亚型流感病毒HA蛋白。方法将H7N9亚型流感病毒的HA蛋白基因扩增并克隆到pFastBacⅠ载体中,构建重组穿梭质粒,转染昆虫sf9细胞后获得重组杆状病毒,对大... 目的为了获得H7N9HA蛋白,利用昆虫杆状病毒表达系统表达了H7N9HA基因并获得重组H7N9亚型流感病毒HA蛋白。方法将H7N9亚型流感病毒的HA蛋白基因扩增并克隆到pFastBacⅠ载体中,构建重组穿梭质粒,转染昆虫sf9细胞后获得重组杆状病毒,对大量培养后表达的H7N9HA蛋白进行SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测。分别在0d和14d用纯化的表达产物HA蛋白免疫小鼠。结果测序鉴定重组表达载体构建正确;SDS-PAGE显示纯化的表达蛋白分子质量为67ku;Western blot分析该蛋白能够被鸡抗流感病毒IgG识别;鸡抗流感病毒抗体间接免疫荧光法测定HA蛋白的表达,在感染HA的昆虫细胞中出现特异性荧光。结论成功的表达了H7N9的HA蛋白,并且此HA蛋白能成功的诱导小鼠体内的免疫反应,并起到良好的保护作用。 展开更多

关键词 流感病毒 H7N9HA蛋白 杆状病毒表达系统

原文传递

一株鸭源禽4型副粘病毒的分离鉴定及遗传进化特征分析 被引量：1

16

作者 张醒海 李元果 +6 位作者 冯娜 谢英 王铁成 孙伟洋 何健 高玉伟 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第2期116-120,共5页

目的对不明原因死亡的家鸭进行病原鉴定及分离,对其全基因序列进行遗传信息系统发育分析,初步揭示病原的致病性和传播特点,为进一步研究禽4型副粘病毒的致病与传播机制提供科学依据。方法采集病死鸭脏器,经处理后接种SPF鸡胚,分离具有... 目的对不明原因死亡的家鸭进行病原鉴定及分离,对其全基因序列进行遗传信息系统发育分析,初步揭示病原的致病性和传播特点,为进一步研究禽4型副粘病毒的致病与传播机制提供科学依据。方法采集病死鸭脏器,经处理后接种SPF鸡胚,分离具有血液凝集特性的病原体。通过随机聚合酶链反应,用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,登录NCBI数据库进行BLAST比对以确定分离毒株种类;通过Sanger测序技术对病毒进行全基因组测序,采用MEGA7.0软件进行序列比对,通过邻近归并法(Neighbor-Joining)构建种系发生进化树分析其基因特征。结果分离到1株血液凝集特性的病原体(SDD01),通过电镜观察、随机聚合酶链反应及测序确定为禽4型副粘病毒。PCR扩增得到其-NP-P-M-F-HN-基因全长序列以及L基因的完整CDS区。F基因氨基酸基序分析显示,蛋白切割位点为DVQPR↓F,MDT>144h,ICPI为0。系统发育分析毒株位于东半球谱系中Ib进化分支,与APMV-4/Mallard/Hubei/2014等野鸟源病毒株同源性为99.4%。结论在死亡家鸭脏器中分离到禽4型副粘病毒。该病毒对鸡的致病性较低,系统发育分析其F基因与野鸟源禽4型副粘病毒同源性为99.3%~99.4%,表明家鸭感染的禽4型副粘病毒可能由野鸟引入,并可在家禽和野鸟之间循环传播。 展开更多

关键词 禽4型副粘病毒 分离鉴定 进化分析

原文传递

禽源H3N2流感病毒NA基因G170R突变对奥司他韦耐药性的分析

17

作者 方树珊 李元果 +10 位作者 夏青 张亚敏 张醒海 赵梦琳 何健 孙伟洋 王铁成 冯娜 夏咸柱 岳冬辉 高玉伟 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第4期397-400,共4页

目的探讨H3N2小鼠适应株NA基因G170R突变,对奥司他韦是否具有耐药性。方法在小鼠鼻内接种病毒前后分别给小鼠灌胃奥司他韦,分为预防治疗组,治疗组,病毒感染对照组,空白对照组。观察小鼠体重变化情况及死亡情况,每三日各组取肺组织,测定... 目的探讨H3N2小鼠适应株NA基因G170R突变,对奥司他韦是否具有耐药性。方法在小鼠鼻内接种病毒前后分别给小鼠灌胃奥司他韦,分为预防治疗组,治疗组,病毒感染对照组,空白对照组。观察小鼠体重变化情况及死亡情况,每三日各组取肺组织,测定肺组织病毒滴度。结果预防治疗组和治疗组的小鼠在鼻内接种病毒后体重都有所下降,但在感染后期小鼠体重都升高并且无死亡;病毒感染对照组小鼠在鼻内接种病毒后体重迅速下降,直至第8 d小鼠全部死亡。病毒感染对照组小鼠肺病毒滴度比预防治疗组和治疗组小鼠肺病毒滴度高,且到实验第8 d,病毒感染对照组小鼠全部死亡,而预防治疗组小鼠和治疗组小鼠肺病毒滴度都在检测值以下。结论 NA基因G170R突变的H3N2小鼠适应株对奥司他韦暂无耐药作用。 展开更多

关键词 奥司他韦 流感病毒 耐药性 小鼠

原文传递

野鸟源H5N8禽流感病毒遗传变异分析与致病性评估 被引量：6

18

作者 张醒海 李元果 +12 位作者 王铁成 初冬 孙贺廷 孙伟洋 冯娜 谢英 何健 秦思源 彭鹏 赵永坤 杨松涛 高玉伟 夏咸柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期646-654,共9页

本试验在野鸟禽流感病毒紧急疫情检测过程中鉴定并分离到1株H5N8高致病性禽流感病毒,利用病毒全基因组测序、系统发育及关键氨基酸位点分析解析了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株遗传进化情况,通过体外复制动力学试验及小鼠感染试验,评价... 本试验在野鸟禽流感病毒紧急疫情检测过程中鉴定并分离到1株H5N8高致病性禽流感病毒,利用病毒全基因组测序、系统发育及关键氨基酸位点分析解析了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株遗传进化情况,通过体外复制动力学试验及小鼠感染试验,评价了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株对哺乳动物致病性。进化分析显示,该病毒株属于Clade 2.3.4.4,可以不经适应直接感染小鼠并在呼吸系统内复制,表现出有限的组织嗜性,对小鼠呈低致病性。其在体内外复制能力较低。结果表明,本试验加深了对野生鸟携带H5N8禽流感病毒的认识和理解、对野鸟源H5N8禽流感病毒生物学特性的评价,为预测野鸟源H5N8禽流感病毒遗传进化趋势及其生物安全风险评估提供借鉴和参考。 展开更多

关键词 野鸟 H5N8 禽流感病毒 遗传变异 致病性

原文传递

新型冠状病毒RBD区重组流感病毒的拯救及初步鉴定

19

作者 王振飞 孙伟洋 +12 位作者 王宇田 赵梦琳 王文琪 朱梦涵 孙悦 李东旭 徐嘉奇 王铁成 冯娜 杨松涛 赵永坤 夏咸柱 高玉伟 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第2期125-129,135,共6页

目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-54... 目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-541aa),对B型流感病毒B/Yamagata/16/88/的NS1片段进行设计改造并插入RBD序列,构建重组质粒NS110-RBD。将NS110-RBD与其余7个骨架株重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞,拯救表达新型冠状病毒RBD区重组流感病毒,对拯救出的毒株进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和Western blot检测。结果成功拯救出重组流感病毒株并命名为rIBV-NS110-RBD。PCR鉴定RBD目的基因大小正确,测序表明拯救病毒株的序列正确,在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征。经测定,拯救株rIBV-NS110-RBD在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/ml,在鸡胚上的病毒滴度为10^(6.5) EID_(50)/ml,血凝效价最高达2_(5);Western Blot检测到RBD的表达,其分子质量为35ku。结论成功拯救出高表达新型冠状病毒RBD蛋白的高血凝效价的重组流感病毒株,该病毒具有流感病毒粒子的典型特征,为以B型流感病毒为载体作为新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 B型流感病毒 反向遗传学 RBD

原文传递

一株野鸟源H16N3亚型禽流感病毒的遗传进化分析与感染能力评估

20

作者 孙雷云 李元果 +10 位作者 张醒海 赵梦琳 胡鑫宇 王铁成 孙伟洋 冯娜 赵永坤 杨松涛 夏咸柱 孟德荣 高玉伟 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第12期1370-1376,共7页

目的了解H16N3亚型禽流感病毒的遗传进化特征及其生物学特性,为野鸟源禽流感病毒预警提供科学依据。方法采集途径我国中东部地区重要候鸟栖息地的野鸟粪便样品,经处理后接种SPF鸡胚,获得具有血液凝集特性病原体,经全基因测序确定病毒亚... 目的了解H16N3亚型禽流感病毒的遗传进化特征及其生物学特性,为野鸟源禽流感病毒预警提供科学依据。方法采集途径我国中东部地区重要候鸟栖息地的野鸟粪便样品,经处理后接种SPF鸡胚,获得具有血液凝集特性病原体,经全基因测序确定病毒亚型。选取H16亚型流感病毒构建系统发育树并进行分子特性分析。检测病毒受体结合特性,并进行小鼠和家禽感染试验,评价该病毒对哺乳动物和家禽的致病性。结果分离到1株病原体(CZ-638),经全基因组测序及电镜观察,确定为H16N3亚型禽流感病毒。在系统发育树种,该毒株位于欧亚谱系分支。氨基酸位点分析显示,HA蛋白裂解位点为INER↓GLF,符合低致病性禽流感病毒分子特征,受体结合域的228位点由G(甘氨酸)突变为S(丝氨酸)。该病毒株能够凝集绵羊红细胞、正常鸡红细胞及仅有SAα2,6受体的鸡红细胞,表明该毒株具有双受体结合能力。动物感染试验显示,该毒株对小鼠、1周龄雏鸡、亚成体家鸭均不具有感染力。结论分离的H16N3毒株为欧亚谱系,对小鼠和家禽无致病性。该毒株存在结合人上呼吸道流感病毒受体的能力,但尚未获得感染家禽和哺乳动物的能力,应持续监测,追踪病毒进化特征。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H16N3 遗传进化 致病性 受体结合特性 感染能力

原文传递