结核分枝杆菌6 kD早期分泌靶抗原单克隆抗体的制备及其特异性分析

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作者 宁唤唤 任瑞 +5 位作者 康健 白鹭 路延之 谢燕玲 张芳琳 柏银兰 《中国医药导报》 CAS 2023年第5期20-23,共4页

目的制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化... 目的制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化mAb。酶联免疫吸附试验法分析mAb亚类和相对亲和力,蛋白印迹法检测其特异性。结果制备了可分泌ESAT-6抗体的杂交瘤细胞系,获得了纯化的mAb。mAb亚型为IgG1,相对亲和力为3.9×10^(-5)。该mAb可特异性识别Mtb的ESAT-6。结论制备抗ESAT-6的mAb为ESAT-6用于结核病诊断与防治制剂及其机制研究奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 分泌蛋白 6 kD早期分泌靶抗原 单克隆抗体

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卡介苗对1型糖尿病小鼠的免疫治疗作用及其机制

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作者 康亚莉 扈启宽 +8 位作者 宁唤唤 周洁 任瑞 康健 路延之 韦垠 高晓菁 张琳娜 柏银兰 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期768-775,共8页

目的评价卡介苗(BCG)对1型糖尿病(T1DM)小鼠的免疫治疗效果,并探索其作用机制。方法将15只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为造模组(n=10,腹腔注射50 mg/kg链尿佐菌素建立T1DM模型)与对照组(n=5,腹腔注射等量柠檬酸缓冲液);取造模成功即随... 目的评价卡介苗(BCG)对1型糖尿病(T1DM)小鼠的免疫治疗效果,并探索其作用机制。方法将15只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为造模组(n=10,腹腔注射50 mg/kg链尿佐菌素建立T1DM模型)与对照组(n=5,腹腔注射等量柠檬酸缓冲液);取造模成功即随机血糖≥16.7 mmol/L的10只小鼠分为T1DM组(n=5)与卡介苗(BCG)组(n=5)。随后BCG组小鼠经皮下注射BCG 1×10^(6) cfu/只进行免疫治疗,4周后加强免疫治疗1次,T1DM组与对照组注射相同剂量磷酸盐缓冲液(PBS)。在实验周期(13周)内,每周监测小鼠体重和进食量变化,尾静脉采血检测各组小鼠血糖水平,采用口服葡萄糖耐量实验(OGTT)检测各组小鼠葡萄糖负荷后的血糖调节能力。采用HE染色观察各组小鼠胰腺组织病理变化,免疫组化染色检测胰腺胰岛素水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠血清C-肽含量,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组小鼠脾组织细胞因子mRNA水平,流式细胞术检测各组小鼠脾细胞中调节性T细胞(Treg)比例。结果BCG免疫治疗2次后(第13周),T1DM组小鼠血糖水平明显高于对照组(P<0.001),而BCG组血糖水平虽高于对照组(P<0.01),但明显低于T1DM组(P<0.01)。OGTT结果显示,3组小鼠在葡萄糖灌胃后血糖水平迅速升高,120 min时开始下降,到180 min时,对照组小鼠血糖水平降至正常水平;与对照组比较,T1DM组及BCG组小鼠在120 min后血糖水平虽有下降趋势,但在180 min时仍明显高于对照组(P<0.001),而BCG组与T1DM组间差异无统计学意义(P>0.05)。在初次免疫时(第5周),与对照组比较,T1DM组和BCG组小鼠体重增长百分比明显降低(P<0.0001),进食量明显增加(P<0.0001)。BCG免疫治疗2次后(第13周),与对照组比较,T1DM组小鼠体重增长百分比仍明显降低(P<0.0001),进食量明显增加(P<0.0001);与T1DM组比较,BCG组小鼠体重增长百分比增高(P<0.001),进食量减少(P<0.001),且与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色结果显示,与对照组比较,T1DM组小鼠胰岛发生明显的萎缩,而BCG组小鼠胰岛形态与对照组接近,且胰岛内细胞数目明显多于T1DM组。免疫组化染色结果显示,与对照组比较,T1DM组小鼠胰腺中胰岛素阳性面积明显减少(P<0.01),而BCG组胰岛素阳性面积虽然少于对照组(P<0.05),但明显多于T1DM组(P<0.05)。ELISA检测结果显示,与对照组比较,T1DM组、BCG组血清C-肽含量明显降低(P<0.001,P<0.05),但BCG组血清C-肽含量明显高于T1DM组(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,与对照组比较,T1DM组脾组织细胞因子mRNA水平无明显变化(P>0.05);BCG组白细胞介素-2(IL-2)、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)mRNA水平与对照组和T1DM组比较均明显升高(P<0.0001),而γ干扰素(IFN-γ)mRNA水平无明显变化(P>0.05)。流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,T1DM组小鼠体内Treg细胞百分比降低(P<0.05);与T1DM组比较,BCG组小鼠Treg细胞百分比明显增高(P<0.05),且与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论BCG免疫治疗可诱导Treg细胞增多,调节自身免疫应答,并通过减轻胰腺病理损伤、恢复胰岛细胞功能以促进胰岛素分泌,从而降低T1DM小鼠的血糖水平。 展开更多

关键词 卡介苗 1型糖尿病 免疫治疗

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铜绿假单胞菌耐药性与致病性共选择机制研究进展 被引量：13

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作者 宁唤唤 李晶 +5 位作者 王严 李博 王波波 张悦 陈林 沈立新 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期382-388,400,共8页

世界范围内细菌耐药性问题日益严重状况下,包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)在内的病原微生物的致病性与耐药性的共选择、共进化现象引起了人们越来越多的关注和不断深入的研究,这将有助于优化临床治疗方案,为药物治疗和筛... 世界范围内细菌耐药性问题日益严重状况下,包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)在内的病原微生物的致病性与耐药性的共选择、共进化现象引起了人们越来越多的关注和不断深入的研究,这将有助于优化临床治疗方案,为药物治疗和筛选提供新靶点。本文综述了PA致病性与耐药性共选择机制的遗传物质基础,并简单讨论二者变化关系及相关应用。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 耐药性 致病性 共选择 共进化

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结核分枝杆菌调控宿主细胞自噬的分子机制研究进展 被引量：6

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作者 宁唤唤 徐志凯 柏银兰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期849-853,共5页

自噬是真核细胞在进化上较为保守的一种胞内降解系统,能够有效清除衰老细胞器、错误折叠的蛋白、入侵的病原微生物等。结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原菌,为胞内寄生菌,可逃避宿主免疫防御屏障而在巨噬细胞中存活。自噬信号的缺乏和抑... 自噬是真核细胞在进化上较为保守的一种胞内降解系统,能够有效清除衰老细胞器、错误折叠的蛋白、入侵的病原微生物等。结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原菌,为胞内寄生菌,可逃避宿主免疫防御屏障而在巨噬细胞中存活。自噬信号的缺乏和抑制是MTB逃逸巨噬细胞免疫识别和杀伤的关键因素之一。MTB的脂类、蛋白质、核酸以及宿主免疫应答产生的抗MTB因子均参与调控巨噬细胞自噬。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 自噬 机制 综述

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抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原(Ag85B-ESAT-6)亚单位疫苗黏膜免疫对结核分枝杆菌的免疫应答

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作者 宁唤唤 张芳琳 +7 位作者 康健 王立飞 路延之 任瑞 白鹭 梁璇 谢燕玲 柏银兰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期886-892,共7页

目的评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法分别用AE、AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T... 目的评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法分别用AE、AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和Th2细胞的IL-10分泌水平,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、IL-2、IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。MTB静脉感染免疫小鼠,ELISA检测感染小鼠血清抗体及脾细胞细胞因子分泌水平,HE染色分析肺病理改变,平板法计数菌落形成单位(CFU)检测脾和肺荷菌数。结果AE和AE联合c-di-AMP经鼻黏膜免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体,促进脾细胞增殖、脾和肺脏Th1/Th2型细胞因子和TNF-α转录增加、脾Th1/Th2型细胞因子分泌增加。小鼠MTB感染后,与对照组相比,AE和AE联合c-di-AMP免疫小鼠特异性抗体水平仍升高,Th1/Th2型细胞免疫应答增强,肺组织呈炎症反应,肺、脾荷菌数显著降低,且AE联合c-di-AMP免疫小鼠肺、脾荷菌数进一步降低。结论AE亚单位疫苗经黏膜接种可诱导小鼠产生体液与细胞免疫应答,并提供对MTB感染的保护力;c-di-AMP为佐剂可在一定程度上提高AE的免疫原性。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌(MTB) 亚单位疫苗 抗原85B(Ag85B) 6kDa早期分泌靶抗原(ESAT-6) 环二腺苷酸(c-di-AMP) 黏膜免疫

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卡介苗诱导的固有免疫记忆 被引量：4

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作者 柏银兰 宁唤唤 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期949-953,共5页

固有免疫记忆是机体初次感染后对相同或不同病原体再次感染的高反应性,是一种不依赖T、B细胞适应性免疫的、记忆性的固有免疫应答,又称为训练免疫。训练免疫机制涉及免疫、代谢组及表观遗传之间复杂的相互作用。卡介苗(BCG)接种后诱导... 固有免疫记忆是机体初次感染后对相同或不同病原体再次感染的高反应性,是一种不依赖T、B细胞适应性免疫的、记忆性的固有免疫应答,又称为训练免疫。训练免疫机制涉及免疫、代谢组及表观遗传之间复杂的相互作用。卡介苗(BCG)接种后诱导的固有免疫在结核分枝杆菌感染免疫中具有重要作用,而且对非分枝杆菌再感染及肿瘤亦具有交叉免疫作用,其机制为BCG诱导的训练免疫。我们总结了训练免疫的概念及机制、BCG诱导的训练免疫及作用机制。 展开更多

关键词 固有免疫记忆 训练免疫 卡介苗(BCG) 结核分枝杆菌 综述

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BCG免疫对2型糖尿病小鼠血糖和免疫应答的影响 被引量：4

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作者 王辛 宁唤唤 +3 位作者 翟佳佳 康健 柏银兰 周洁 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1526-1530,共5页

目的:探究BCG免疫对2型糖尿病小鼠血糖和免疫应答的影响。方法:BCG经尾静脉注射小鼠,高糖高脂饮食联合小剂量多次腹腔注射链尿佐菌素建立2型糖尿病模型。检测小鼠体重、空腹血糖和葡萄糖耐量试验血糖水平,测定小鼠细胞免疫应答水平。结... 目的:探究BCG免疫对2型糖尿病小鼠血糖和免疫应答的影响。方法:BCG经尾静脉注射小鼠,高糖高脂饮食联合小剂量多次腹腔注射链尿佐菌素建立2型糖尿病模型。检测小鼠体重、空腹血糖和葡萄糖耐量试验血糖水平,测定小鼠细胞免疫应答水平。结果:BCG免疫下调2型糖尿病小鼠空腹血糖和糖负荷后的血糖水平; BCG免疫促进Th1型细胞反应,显著抑制2型糖尿病小鼠Th2型细胞因子的释放。结论:BCG免疫可能通过抑制2型糖尿病小鼠炎症因子的释放下调其血糖水平,有助于延缓糖尿病的发展进程。 展开更多

关键词 糖尿病 血糖 BCG 免疫应答

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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性 被引量：3

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作者 谢燕玲 宁唤唤 +6 位作者 梁璇 康健 任瑞 张慧 张娜娜 路延之 柏银兰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期387-393,共7页

目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT6... 目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^(-7) g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 MPT64 分泌蛋白 单克隆抗体

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结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答 被引量：1

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作者 白鹭 宁唤唤 +6 位作者 康健 梁璇 谢燕玲 彭钰君 张婧瑶 路延之 柏银兰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期379-386,共8页

目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。... 目的研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 6kDa早期分泌靶抗原分泌系统蛋白V(EsxV) 亚单位疫苗 黏膜免疫 环二腺苷酸

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卡介苗诱导的训练免疫及其抗病毒感染作用

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作者 柏银兰 路延之 +1 位作者 宁唤唤 徐志凯 《微生物与感染》 CAS 2022年第4期259-267,共9页

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是目前唯一获准使用的预防结核病的疫苗。除结核分枝杆菌外,BCG对其他细菌、病毒和寄生虫等非同源病原体感染也具有非特异性的保护作用,还可用于一些肿瘤和自身免疫性疾病的免疫治疗,其机制... 卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是目前唯一获准使用的预防结核病的疫苗。除结核分枝杆菌外,BCG对其他细菌、病毒和寄生虫等非同源病原体感染也具有非特异性的保护作用,还可用于一些肿瘤和自身免疫性疾病的免疫治疗,其机制研究表明与训练免疫有关。BCG诱导的训练免疫机制包括引起宿主天然免疫细胞代谢改变、表观遗传重编程及其对再刺激增强的免疫应答。BCG诱导的训练免疫具有抗多种病毒感染的保护作用,且与2019冠状病毒病的死亡率呈负相关,可能会削弱新发病原体在未来大流行中的影响。 展开更多

关键词 卡介苗 训练免疫 病毒 疫苗 2019冠状病毒病

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结核分枝杆菌EsxV脂质体纳米颗粒亚单位疫苗的制备及免疫学特性 被引量：1

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作者 白鹭 路延之 +8 位作者 宁唤唤 康亚莉 谢燕玲 康健 李雪 崔若囡 韦垠 刘月芹 柏银兰 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4085-4097,共13页

本研究旨在制备脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)为载体的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原EsxV亚单位疫苗,明确该疫苗经黏膜免疫诱导的免疫应答水平。采用薄膜分散法制备包裹蛋白EsxV和c-di-AMP的LNP(EsxV:C:... 本研究旨在制备脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)为载体的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原EsxV亚单位疫苗,明确该疫苗经黏膜免疫诱导的免疫应答水平。采用薄膜分散法制备包裹蛋白EsxV和c-di-AMP的LNP(EsxV:C:L),并对其包封率、LNP形态、粒径、表位电荷及多相分散指数进行了检测。EsxV:C:L滴鼻免疫BALB/c小鼠,检测免疫后血清和黏膜抗体、肺或脾细胞因子转录及分泌水平、肺T细胞亚群细胞比例。结果成功获得大小均一、呈球状、带负电的EsxV:C:L LNP亚单位疫苗。与EsxV:C相比,EsxV:C:L鼻黏膜接种可诱导小鼠呼吸道黏膜sIgA水平增加,脾细胞因子IL-2分泌水平升高,提高中央记忆T细和组织驻留T细胞的比例。综上,EsxV:C:L经黏膜免疫,可诱导更强的黏膜免疫和记忆性T细胞免疫应答,可能提供更好的抗Mtb感染的保护作用。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 EsxV 环二腺苷酸 脂质体纳米颗粒 亚单位疫苗

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耻垢分枝杆菌感染人脐带间充质干细胞模型的建立及其特征

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作者 康亚莉 宁唤唤 +7 位作者 谢燕玲 任瑞 白鹭 路延之 康健 韦垠 张琳娜 柏银兰 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期5031-5044,共14页

【背景】结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)休眠菌形成被认为是潜伏结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)的主要原因,但目前缺乏体内和体外模型进行机制研究。新近研究表明Mtb可感染间充质干细胞(mesenchymal stem... 【背景】结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)休眠菌形成被认为是潜伏结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)的主要原因,但目前缺乏体内和体外模型进行机制研究。新近研究表明Mtb可感染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)并以休眠状态在细胞中长期存活。然而Mtb感染细胞模型存在周期长和生物安全要求高等问题,需要探索可用的MSC感染细胞模型用于Mtb休眠机制的研究。【目的】建立快速生长型耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord MSC,hUCMSC)的细胞模型并研究其特征。【方法】取分离好的hUCMSC,流式细胞术鉴定其表面标志性抗原;以Ms菌株感染hUCMSC,DiI标记细胞膜,荧光显微镜下观察细胞吞噬作用;平板法计数Ms胞内存活率;油红O染色观察细胞脂滴形成;鬼笔环肽荧光染色观察细胞骨架变化;实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)检测Ms感染的hUCMSC脂质代谢、静息和分化相关基因转录水平。【结果】Ms感染hUCMSC后在胞内以非复制方式存活,其感染率与感染复数呈正相关;Ms感染hUCMSC可诱导脂滴合成相关基因表达,而抑制降解相关基因转录水平,从而促进细胞内脂滴形成。Ms感染促进hUCMSC细胞骨架发生重构,RT-qPCR检测结果显示细胞增殖和分化相关基因表达增加,Ms感染促进hUCMSC向成脂、成骨细胞分化。【结论】本研究建立了可模拟Mtb休眠形成的Ms感染hUCMSC模型,可进一步用于LTBI机制的相关研究。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 间充质干细胞 休眠菌 结核潜伏感染

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结核分枝杆菌MPT64双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用 被引量：1

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作者 谢燕玲 宁唤唤 +7 位作者 路延之 康健 白鹭 代婷 胡家豪 徐子晴 刘博 柏银兰 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第11期1284-1290,共7页

目的建立结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的双抗体夹心ELISA检测方法并评价初步应用效果。方法采用间接ELISA和ELISA叠加试验在各株抗MPT64 mAb中筛选出亲和力较高的识别不同抗原表位的配对抗体;Protein A... 目的建立结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的双抗体夹心ELISA检测方法并评价初步应用效果。方法采用间接ELISA和ELISA叠加试验在各株抗MPT64 mAb中筛选出亲和力较高的识别不同抗原表位的配对抗体;Protein A亲和层析纯化配对的2株mAb腹水,其中1株mAb偶联生物素(Biotin)作为检测抗体,另1株作为捕获抗体,棋盘滴定法优化捕获抗体和检测抗体的工作浓度,建立双抗体夹心ELISA方法;以常规条件作为初始反应条件,依次优化包被、封闭、抗原、抗体以及底物反应环节的条件;以MPT64抗原检测评估建立的ELISA方法的检测限、线性范围、精确性、准确性和特异性;采用该方法检测Mtb H37Ra不同阶段培养上清中MPT64含量,初步评价应用效果。结果ELISA法成功筛选出配对抗体H2F4和A5B2 mAb;液相色谱法从腹水中纯化获得的mAb滴度分别为1∶102400、1∶51200。以生物素偶联的A5B2 mAb作为检测抗体,以H2F4 mAb为捕获抗体,建立并优化MPT64双抗体夹心ELISA方法,确定的试验条件为:1.25μg/mL H2F4 mAb包被酶标板,4℃静置过夜,洗涤;2%BSA室温封闭1 h,洗涤;加入待测样品室温孵育2 h,洗涤;加入2.5μg/mL Biotin-A5B2 mAb室温孵育2 h,洗涤;加入0.5μg/mL Avidin-HRP室温孵育1 h,洗涤;加入TMB显色检测。该ELISA方法对MPT64蛋白的检测下限为39 ng/mL,线性范围为39~1250 ng/mL,具有良好的特异性;该方法检测Mtb培养物,第12 d培养上清呈阳性反应。结论建立的Mtb MPT64双抗体夹心ELISA方法精确性、准确性,特异性良好,可用于MPT64定量检测和Mtb生长检测,为TB快速诊断试剂的研制提供了实验依据。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 分泌抗原 MPT64 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA

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提升医学微生物学研究人员生物安全意识的管理与探讨

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作者 柏银兰 张芳琳 +2 位作者 路延之 宁唤唤 康健 《医学动物防制》 2023年第10期1011-1017,共7页

随着新冠肺炎疫情的不断蔓延,生物安全显得尤其重要。结合某校微生物与病原生物学教研室的管理制度,本文分别从强化生物安全实验室等级概念、培养生物安全意识、建立良好实验习惯、规范科研人员实验操作、正确使用实验室科学仪器、提高... 随着新冠肺炎疫情的不断蔓延,生物安全显得尤其重要。结合某校微生物与病原生物学教研室的管理制度,本文分别从强化生物安全实验室等级概念、培养生物安全意识、建立良好实验习惯、规范科研人员实验操作、正确使用实验室科学仪器、提高科研人员实验技能、安全处理实验废弃物7个方面,探讨如何提升医学微生物学研究人员平时工作的生物安全意识,有效保证研究人员人身安全和实验室环境安全,为科研工作顺利进行奠定基础。 展开更多

关键词 医学微生物学 研究人员 生物安全意识 实验室管理 危险因素 调查

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细菌耐药性的起源与演变 被引量：7

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作者 王严 宁唤唤 +3 位作者 梁鹰 王波波 李博 沈立新 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期855-861,共7页

细菌的耐药性问题不断加剧,已经引起了全球研究人员的关注。然而,早在使用抗生素之前,细菌的耐药基因的雏形就已经存在于自然环境中并且来源广泛,其耐药性的演变也经历了复杂的过程。本文结合国内外的相关研究,对细菌耐药基因的起源、... 细菌的耐药性问题不断加剧,已经引起了全球研究人员的关注。然而,早在使用抗生素之前,细菌的耐药基因的雏形就已经存在于自然环境中并且来源广泛,其耐药性的演变也经历了复杂的过程。本文结合国内外的相关研究,对细菌耐药基因的起源、耐药性的演变及耐药机制等方面进行综述,期望为研究细菌的耐药机理和预测耐药性的演变提供参考。 展开更多

关键词 耐药基因的起源 耐药性的演变 主动耐药机制 被动耐药机制

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铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因的筛选 被引量：5

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作者 张悦 梁文 +5 位作者 祁婧 宁唤唤 郭俏 陈林 段康民 沈立新 《中国科学：生命科学》 CSCD 北大核心 2014年第11期1159-1167,共9页

为了在基因组水平筛选获得铜绿假单胞菌PAO1对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因,本研究通过构建PAO1转座突变体文库、筛选对亚胺培南、美罗培南和比亚培南耐药及敏感突变株;通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对的手段,确定了突变体中转座子... 为了在基因组水平筛选获得铜绿假单胞菌PAO1对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因,本研究通过构建PAO1转座突变体文库、筛选对亚胺培南、美罗培南和比亚培南耐药及敏感突变株;通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对的手段,确定了突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因,获得了48个PAO1中对碳青霉烯类抗生素耐药和敏感相关的基因,其中27个基因突变后表现为耐药性增强,21个基因突变后表现为药物敏感性增强.本实验筛选获得的48个基因中有5个与Alvarez-Ortega和Dotsch等人筛选的基因重复.通过对PA0011,PA0667及PA3901进行基因敲除及遗传互补,进一步确证这3个基因均与PAO1对碳青霉烯类的耐药性相关.本次筛选发现了38个新的与碳青霉烯类耐药相关的基因,其中包括13个class4类基因.对这些新基因的进一步研究,不仅有利于全面了解铜绿假单胞菌的耐药机制及其调控网络,而且有利于药物作用靶点的发现,为有效治疗铜绿假单胞菌的感染提供新思路. 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 碳青霉烯类抗生素 碳青霉烯类耐药相关 基因

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分枝杆菌持续感染小鼠模型的建立及其特征分析 被引量：4

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作者 宁唤唤 路延之 +7 位作者 康健 许艳慧 王立飞 王莹 姚庆港 宋世杰 徐志凯 柏银兰 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第3期219-223,共5页

目的建立不同毒力的分枝杆菌持续感染小鼠模型并分析其免疫应答特征,为结核病新型疫苗及药物评价研究奠定基础。方法分别用结核分枝杆菌(Mtb)标准毒株H37Rv、减毒株H37Ra及疫苗株BCG经尾静脉注射感染BALB/c小鼠,5×10~4 CFU/只。感... 目的建立不同毒力的分枝杆菌持续感染小鼠模型并分析其免疫应答特征,为结核病新型疫苗及药物评价研究奠定基础。方法分别用结核分枝杆菌(Mtb)标准毒株H37Rv、减毒株H37Ra及疫苗株BCG经尾静脉注射感染BALB/c小鼠,5×10~4 CFU/只。感染后4、8周观察小鼠一般状态及体重变化;观察脾脏大体情况和肺组织病理改变;检测分枝杆菌特异性抗体水平、脾淋巴细胞刺激指数(SI)及Th1/Th2细胞因子分泌情况;采用平板计数法计脾、肺脏荷菌数CFUs。结果不同毒力分枝杆菌感染8周后,各组小鼠体重无显著差异;H37Rv感染组脾脏体积显著增大,肺组织病理切片显示菌株感染可引起不同程度的病理损伤;感染4周后小鼠血清特异性抗体水平升高,且感染后8周抗体水平高于4周水平,但不同菌株感染组间差异无统计学意义;不同毒力分枝杆菌感染小鼠的脾淋巴细胞刺激指数(SI)均升高,以H37Rv和H37Ra感染组脾淋巴细胞增殖更显著。H37Rv感染4周后IFN-γ、IL-10分泌水平显著升高(P<0.05)。感染4周后,H37Rv小鼠脾脏荷菌数Log_(10)CFU显著高于BCG组,为4.389±0.1245,而H37Ra感染组与BCG组无显著差异,为4.068±0.2184;各感染组肺荷菌数Log_(10)CFU无显著差异;感染8周后,H37Ra、H37Rv感染组小鼠脾脏荷菌数显著高于BCG组(P<0.05),而肺部荷菌数组间无差异。小鼠呈现持续感染状态。结论本研究成功建立了不同毒力分枝杆菌持续感染小鼠模型,该模型可用于结核病疫苗及药物的研发及筛选。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 小鼠模型 持续感染

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病原菌耐药组的研究进展 被引量：1

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作者 王严 宁唤唤 +3 位作者 梁鹰 杨赛 高浪 沈立新 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期1561-1568,共8页

世界范围内病原菌耐药性不断增强,给临床治疗带来了极大的挑战,这一现象引起了全球研究者的高度关注。近年来,随着对病原菌耐药组研究的不断深入,越来越多的耐药基因被发现,这为寻找新的药物靶点以及预测临床条件下细菌耐药性的发展提... 世界范围内病原菌耐药性不断增强,给临床治疗带来了极大的挑战,这一现象引起了全球研究者的高度关注。近年来,随着对病原菌耐药组研究的不断深入,越来越多的耐药基因被发现,这为寻找新的药物靶点以及预测临床条件下细菌耐药性的发展提供了新的理论依据。本文结合近年来国内外的相关研究,从病原菌耐药组的定义、研究方法和研究现状等方面进行了综述,期望为全面研究细菌耐药-毒性-代谢之间的关系,为细菌耐药性的研究提供新思路。 展开更多

关键词 病原菌耐药组 耐药组定义 耐药组研究方法 耐药组研究进展

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c-di-AMP在细菌感染与免疫中的作用 被引量：3

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作者 宁唤唤 徐志凯 柏银兰 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期2362-2369,共8页

环二腺苷酸(Cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是细菌中广泛存在的第二信号分子。c-di-AMP在细菌中的代谢受二腺苷酸环化酶(Diadenylatecyclase, DAC)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)的精密调控。c-di-AMP不仅调节细菌... 环二腺苷酸(Cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是细菌中广泛存在的第二信号分子。c-di-AMP在细菌中的代谢受二腺苷酸环化酶(Diadenylatecyclase, DAC)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)的精密调控。c-di-AMP不仅调节细菌生长、细胞壁稳态、离子转运等多种生理过程,而且能够被真核宿主胞内多种感应子/受体蛋白识别,从而调控抗感染免疫。细菌c-di-AMP参与调控宿主I型干扰素应答、NF-κB信号通路活性、自噬以及炎症小体应答等固有免疫应答。此外,c-di-AMP作为黏膜佐剂可诱导宿主适应性免疫。c-di-AMP被认为是一种新发现的病原体相关的分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),已成为细菌疫苗和药物研究中的新靶点。 展开更多

关键词 环二腺苷酸 细菌 感染 免疫 固有免疫

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小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：2

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作者 陆翮 高子昭 +3 位作者 康健 许艳慧 宁唤唤 柏银兰 《生物技术》 CAS 2018年第3期223-229,261,共8页

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋... [目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。 展开更多

关键词 DHH结构域 Prune蛋白 原核表达 多克隆抗体

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