目的:构建ZCH-7-2F9(简称2F9)单链抗体(ScFv2F9)原核表达载体,获得活性目的蛋白,为2F9免疫毒素及其它类型的基因工程抗体的研究奠定基础。方法:根据VH2F9、VL2F9、(G4S)3基因序列以及pIVEX2.3-MCS空载体多克隆位点内切酶位点NdeI和SmaI...目的:构建ZCH-7-2F9(简称2F9)单链抗体(ScFv2F9)原核表达载体,获得活性目的蛋白,为2F9免疫毒素及其它类型的基因工程抗体的研究奠定基础。方法:根据VH2F9、VL2F9、(G4S)3基因序列以及pIVEX2.3-MCS空载体多克隆位点内切酶位点NdeI和SmaI的核酸序列设计引物,采用高保真的Taq酶,通过重叠延伸拚接法(splicing by overlap extension,SOE)扩增克隆到ScFv2F9基因,T-A克隆、测序核实后克隆到pIVEX2.3-MCS空载体中,阳性重组质粒转化大肠杆菌菌株E.coli BL21star(DE3)plysS,IPTG诱导目的蛋白表达,镍树脂纯化后体外复性浓缩,流式细胞术观察其识别和结合CD14的能力。结果:成功构建ScFv2F9的原核表达载体pIVEX2.3-MCS/ScFv2F9;对大肠杆菌的包涵体进行纯化复性,其复性率为32.6%;通过流式细胞术观察到复性ScFv2F9对亲本单抗2F9-FITC有部分的阻滞效果,复性ScFv2F9阻滞1次后阳性细胞百分数、平均荧光强度(MFI)和高峰频道(peakCh)分别下降了11.73%、11.96%和31.57%,阻滞2次后分别下降了26.44%、21.75%和42.11%。结论:ScFv2F9在原核细胞中获得成功表达,复性后目的蛋白对人CD14有一定的识别和结合能力,为2F9单抗的进一步改造打下了坚实的基础。展开更多
目的探讨局部枸橼酸抗凝(RCA)在儿童连续性肾脏替代治疗(CRRT)应用的有效性和安全性。方法回顾性分析2016年7月至2018年1月上海儿童医学中心儿科重症监护病房(PICU)接受RCA抗凝CRRT治疗的20例患儿(枸橼酸组)的临床资料,另选择2007年12月...目的探讨局部枸橼酸抗凝(RCA)在儿童连续性肾脏替代治疗(CRRT)应用的有效性和安全性。方法回顾性分析2016年7月至2018年1月上海儿童医学中心儿科重症监护病房(PICU)接受RCA抗凝CRRT治疗的20例患儿(枸橼酸组)的临床资料,另选择2007年12月至2015年7月接受传统肝素抗凝(HA) CRRT治疗的33例患儿(肝素组)作为对照,比较2组CRRT治疗滤器寿命、凝血指标[血小板计数、部分活化凝血活酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fib)]、电解质变化[离子钙(Ca_(ion)^(2+))、结合钙(Ca_(tot)^(2+))、Ca_(tot)^(2+)/Ca_(ion)^(2+)、pH值、碳酸氢根(HCO-3)]、肝功能[谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)]和活动性出血情况。结果枸橼酸组滤器寿命较肝素组显著延长[(25.8±14.6) h vs (17.4±9.9) h,P<0. 01],枸橼酸组治疗前后血小板计数、APTT、PT、Fib差异无统计学意义(P>0. 05),肝素组CRRT治疗后较治疗前血小板明显下降[(95.6±15.5)×10~9/L vs (127.3±23.8)×10~9/L,P<0. 05]、APTT延长[(76.5±9.0) s vs (52.4±15.5) s,P<0. 05]。枸橼酸组与肝素组住PICU时间[(15.8±11.3) d vs (10. 5±15.7) d]和PICU病死率(40. 0%vs 33.0%)比较差异无统计学意义(P>0. 05)。枸橼酸组治疗后较治疗前Ca_(tot)^(2+)升高[(2.54±0. 40) mmol/L vs (2.25±0. 45) mmol/L,P<0. 05],但治疗前后Ca_(ion)^(2+)、Ca_(tot)^(2+)/Ca_(ion)^(2+)、pH、HCO-3、ALT、TBil比较差异无统计学意义(P>0. 05)。枸橼酸组CRRT治疗期间无新发活动性出血,肝素组治疗期间新发6例肺出血,5例消化道出血,2例深静脉穿刺处皮肤出血。结论 RCA在危重症儿童CRRT治疗是安全、有效的抗凝方式。展开更多
文摘目的:构建ZCH-7-2F9(简称2F9)单链抗体(ScFv2F9)原核表达载体,获得活性目的蛋白,为2F9免疫毒素及其它类型的基因工程抗体的研究奠定基础。方法:根据VH2F9、VL2F9、(G4S)3基因序列以及pIVEX2.3-MCS空载体多克隆位点内切酶位点NdeI和SmaI的核酸序列设计引物,采用高保真的Taq酶,通过重叠延伸拚接法(splicing by overlap extension,SOE)扩增克隆到ScFv2F9基因,T-A克隆、测序核实后克隆到pIVEX2.3-MCS空载体中,阳性重组质粒转化大肠杆菌菌株E.coli BL21star(DE3)plysS,IPTG诱导目的蛋白表达,镍树脂纯化后体外复性浓缩,流式细胞术观察其识别和结合CD14的能力。结果:成功构建ScFv2F9的原核表达载体pIVEX2.3-MCS/ScFv2F9;对大肠杆菌的包涵体进行纯化复性,其复性率为32.6%;通过流式细胞术观察到复性ScFv2F9对亲本单抗2F9-FITC有部分的阻滞效果,复性ScFv2F9阻滞1次后阳性细胞百分数、平均荧光强度(MFI)和高峰频道(peakCh)分别下降了11.73%、11.96%和31.57%,阻滞2次后分别下降了26.44%、21.75%和42.11%。结论:ScFv2F9在原核细胞中获得成功表达,复性后目的蛋白对人CD14有一定的识别和结合能力,为2F9单抗的进一步改造打下了坚实的基础。
文摘目的探讨局部枸橼酸抗凝(RCA)在儿童连续性肾脏替代治疗(CRRT)应用的有效性和安全性。方法回顾性分析2016年7月至2018年1月上海儿童医学中心儿科重症监护病房(PICU)接受RCA抗凝CRRT治疗的20例患儿(枸橼酸组)的临床资料,另选择2007年12月至2015年7月接受传统肝素抗凝(HA) CRRT治疗的33例患儿(肝素组)作为对照,比较2组CRRT治疗滤器寿命、凝血指标[血小板计数、部分活化凝血活酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fib)]、电解质变化[离子钙(Ca_(ion)^(2+))、结合钙(Ca_(tot)^(2+))、Ca_(tot)^(2+)/Ca_(ion)^(2+)、pH值、碳酸氢根(HCO-3)]、肝功能[谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)]和活动性出血情况。结果枸橼酸组滤器寿命较肝素组显著延长[(25.8±14.6) h vs (17.4±9.9) h,P<0. 01],枸橼酸组治疗前后血小板计数、APTT、PT、Fib差异无统计学意义(P>0. 05),肝素组CRRT治疗后较治疗前血小板明显下降[(95.6±15.5)×10~9/L vs (127.3±23.8)×10~9/L,P<0. 05]、APTT延长[(76.5±9.0) s vs (52.4±15.5) s,P<0. 05]。枸橼酸组与肝素组住PICU时间[(15.8±11.3) d vs (10. 5±15.7) d]和PICU病死率(40. 0%vs 33.0%)比较差异无统计学意义(P>0. 05)。枸橼酸组治疗后较治疗前Ca_(tot)^(2+)升高[(2.54±0. 40) mmol/L vs (2.25±0. 45) mmol/L,P<0. 05],但治疗前后Ca_(ion)^(2+)、Ca_(tot)^(2+)/Ca_(ion)^(2+)、pH、HCO-3、ALT、TBil比较差异无统计学意义(P>0. 05)。枸橼酸组CRRT治疗期间无新发活动性出血,肝素组治疗期间新发6例肺出血,5例消化道出血,2例深静脉穿刺处皮肤出血。结论 RCA在危重症儿童CRRT治疗是安全、有效的抗凝方式。
