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雌二醇与ESR1靶向结合通过ERK信号通路调控软骨细胞的增殖 被引量:34
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作者 刘敏 谢巍伟 +3 位作者 郑维 尹丹旸 罗瑞 郭风劲 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期134-143,共10页
目的探讨雌二醇(E2)/ESR1(ERα)对C28I2软骨细胞增殖的影响及可能的分子机制。方法应用Ad-Easy腺病毒包装系统构建和包装过表达腺病毒Ad-ESR1,Western blot及QPCR检测该基因在细胞中蛋白及RNA表达情况。在E2处理下,设立不同病毒感染组处... 目的探讨雌二醇(E2)/ESR1(ERα)对C28I2软骨细胞增殖的影响及可能的分子机制。方法应用Ad-Easy腺病毒包装系统构建和包装过表达腺病毒Ad-ESR1,Western blot及QPCR检测该基因在细胞中蛋白及RNA表达情况。在E2处理下,设立不同病毒感染组处理C28I2细胞,Western blot检测各处理组C28I2细胞的自噬、凋亡相关蛋白的表达及ERK信号通路的磷酸化水平;免疫荧光实验观察细胞内自噬流的强弱;FCM检测各组细胞凋亡率及周期;QPCR检测mRNA水平增殖相关标志基因(PCNA)、细胞周期蛋白B1(CyclinB1)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达。ERK特异性抑制剂处理细胞,Western blot检测抑制ERK通路后自噬及凋亡相关蛋白表达,QPCR检测增殖相关标志基因表达。结果成功构建过表达腺病毒Ad-ESR1。过表达ESR1能够促进E2处理后LC3和ATG7的表达,促进LC3和LAMP1在细胞质中共定位,抑制cleaved caspase3、cleavedcaspase12的表达并且促进PCNA、cyclinB1和cyclinD1表达,且细胞内pERK明显减少;而干扰ESR1表达后,自噬相关蛋白表达减少,自噬流减弱,凋亡蛋白表达增加,增殖标志基因表达下调,细胞内pERK相对增加。特异性抑制剂阻断ERK活化,E2/ESR1诱导的自噬增加以及凋亡减少被抑制,增殖相关基因表达被抑制。结论 E2与ESR1的靶向结合可促进软骨细胞的增殖,其作用机制可能与抑制ERK信号通路活化从而促进自噬、抑制凋亡有关。 展开更多
关键词 ESR1 自噬 凋亡 增殖 ERK信号通路 雌二醇
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rhPGRN通过MAPK/PI3K通路调控自噬和内质网应激并促进细胞增殖 被引量:7
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作者 罗瑞 秦启忠 +2 位作者 刘敏 尹丹旸 郭风劲 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1071-1081,共11页
目的:探讨重组人颗粒体蛋白前体(rhPGRN)对人软骨细胞C28I2和小鼠巨噬细胞RAW264. 7增殖、自噬和内质网应激(ERS)的影响及作用机制。方法:采用Ni-NTA琼脂糖树脂对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化,通过考马斯亮蓝染色、BCA法和Western ... 目的:探讨重组人颗粒体蛋白前体(rhPGRN)对人软骨细胞C28I2和小鼠巨噬细胞RAW264. 7增殖、自噬和内质网应激(ERS)的影响及作用机制。方法:采用Ni-NTA琼脂糖树脂对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化,通过考马斯亮蓝染色、BCA法和Western blot验证目的蛋白的浓度和纯度。将细胞随机分为对照组、rhPGRN组、U0126组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、rhPGRN+U0126、rhPGRN+3-MA、rhPGRN+巴弗洛霉素A1(Baf-A1)和rhPGRN+4-苯基丁酸(4-PBA)组,采用细胞计数法、Western blot和RT-qPCR检测rhPGRN对C28I2和RAW264. 7两种不同类型细胞增殖、自噬和ERS的影响。结果:(1)在含有His标签的PGRN稳转细胞株中成功提取高纯度、具有生物活性的人源重组蛋白rhPGRN。(2)rhPGRN能促进C28I2和RAW264. 7细胞的增殖,促进细胞周期相关分子(PCNA、cyclin B1和cyclin D1)的mRNA表达(P<0. 05),上调细胞周期调控蛋白Ki67表达,并提高增殖相关信号分子ERK和Akt蛋白的磷酸化水平(P<0. 05)。(3)ERK通路抑制剂U0126抑制了rhPGRN诱导的细胞增殖、自噬和ERS(P<0. 05);使用3-MA抑制PI3K/Akt通路后,rhPGRN诱导的细胞自噬被显著抑制(P<0. 05);自噬抑制剂Baf-A1和ERS抑制剂4-PBA显著下调了rhPGRN诱导的Ki67蛋白表达(P<0. 05)。结论:rhPGRN通过MAPK和PI3K/Akt通路调控自噬和ERS,从而促进C28I2和RAW264. 7细胞增殖。 展开更多
关键词 重组人颗粒体蛋白前体 真核表达 细胞增殖 自噬 内质网应激
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IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能 被引量:3
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作者 李星月 尹丹旸 +5 位作者 范梦恬 杨玉有 梁利 冯乃波 李小丽 郭风劲 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期785-793,共9页
目的探究肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)通过调控内质网钙稳态蛋白(CHERP)影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法衣霉素(TM)处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素(Rapa)处理C28... 目的探究肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)通过调控内质网钙稳态蛋白(CHERP)影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法衣霉素(TM)处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素(Rapa)处理C28/I2(分为:NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组),Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠(ERN1 CKO)和对照小鼠(Control)软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA水平,Western blot检测IRE1α/p-IRE1α、CHERP表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)处理原代软骨细胞(分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1组),Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流(分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组)。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.05),p62表达下调(P<0.05)。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(P<0.001),4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1(P<0.01)、ATG5(P<0.001)、ATG7(P<0.001)mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调(P<0.01),CHERP蛋白表达上调(P<0.05),胞内钙离子含量显著上升(P<0.001)。巴佛洛霉素A1处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.01),ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.05)、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降(P<0.05)。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强(P<0.05)。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。 展开更多
关键词 IRE1α 自噬流 钙离子 内质网钙稳态蛋白 软骨细胞
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雌二醇通过ERβ调控ERK磷酸化影响细胞增殖和凋亡 被引量:1
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作者 张梦颖 杨玉有 +4 位作者 刘敏 梁利 罗瑞 尹丹旸 郭风劲 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期336-343,共8页
目的探究雌二醇(E2)结合其重组人雌激素受体β(ESR2)对C28I2细胞增殖和凋亡的效应。方法PCR扩增ESR2序列并构建腺病毒重组质粒pAd-ESR2,在HEK293细胞中包装重组腺病毒Ad-ESR2。用Ad-ESR2和ESR2-siRNA处理人正常软骨细胞C28I2,分别设置... 目的探究雌二醇(E2)结合其重组人雌激素受体β(ESR2)对C28I2细胞增殖和凋亡的效应。方法PCR扩增ESR2序列并构建腺病毒重组质粒pAd-ESR2,在HEK293细胞中包装重组腺病毒Ad-ESR2。用Ad-ESR2和ESR2-siRNA处理人正常软骨细胞C28I2,分别设置对照组(C28I2+DMSO)、E2组(C28I2+E2)、Ad-ESR2组(C28I2+DMSO+Ad-ESR2)、E2+Ad-GFP组(C28I2+E2+Ad-GFP)、E2+Ad-ESR2组(C28I2+E2+Ad-ESR2)、E2+sicontrol组(C28I2转染sicontrol+E2)、E2+ESR2-si1组(C28I2转染ESR2-si1+E2)、E2+ESR2-si3组(C28I2转染ESR2-si3+E2)。免疫印迹测定ER Stress和细胞凋亡相关蛋白表达,qRT-PCR检测增殖相关标志基因的表达,借助EdU试剂盒和流式细胞术测定细胞增殖和凋亡情况。使用ERK通路抑制剂U0126分别设定E2组、E2+U0126组(C28I2+E2+U0126)、E2+Ad-ESR2组、E2+Ad-ESR2+U0126组(C28I2+E2+Ad-ESR2+U0126)。通过免疫印迹实验探究C28I2细胞中E2通过ERβ调控ERK信号通路影响ER stress和凋亡。结果成功构建过表达腺病毒Ad-ESR2和靶向ESR2的siRNA;过表达Ad-ESR2能够促进E2处理后IRE1α[1.20±0.06 vs 0.95±0.05,P<0.05]、PERK[1.29±0.04 vs 1.03±0.02,P<0.05]和XBP1s[1.17±0.03 vs 0.82±0.02,P<0.05]的表达,促进凋亡Cleaved Caspase12(P<0.05)、抑制增殖相关标志基因PCNA(P<0.05)、CyclinB1(P<0.05)、CyclinD1(P<0.05)的表达,且ERK磷酸化激活降低(P<0.05);转染ESR2-siRNA后,细胞的内质网应激相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达降低,与细胞增殖相关的基因被上调,且细胞内pERK/ERK比值相对增加。经特异性ERK通路抑制剂U0126处理后,雌二醇结合ERβ促进的内质网应激蛋白及细胞凋亡蛋白的表达被拮抗。结论雌二醇靶向ERβ通过激活ERK通路磷酸化调控内质网应激及凋亡,进而抑制软骨细胞增殖。 展开更多
关键词 雌二醇 重组人雌激素受体β 内质网应激 凋亡 增殖 ERK信号通路
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