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转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测 被引量：7
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作者 郭亚璐 马晓飞 +12 位作者 史佳楠 张柳 张剑硕 黄腾 武鹏程 康昊翔 耿广荟 陈浩 魏健 窦世娟 李莉云 尹长城 刘国振 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第19期3631-3639,共9页
【目的】制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体,建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法,了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以带Cas9的质粒DNA为模板,PCR扩增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到p ET30a载体中,将酶切验证且... 【目的】制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体,建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法,了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以带Cas9的质粒DNA为模板,PCR扩增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到p ET30a载体中,将酶切验证且序列正确的重组质粒转入表达菌Condon Plus中,经IPTG诱导表达CAS9蛋白质(N端270氨基酸),用纯化的重组蛋白质作为免疫原免疫小鼠,制备单克隆抗体,用免疫印迹分析筛选特异性和灵敏度高的抗体细胞株。用特异性引物PCR扩增转基因水稻的Cas9,用免疫印迹检测转基因水稻中的CAS9蛋白质。将重组CAS9蛋白质和带有CAS9的水稻苗期叶片蛋白质进行平行免疫印迹分析,用Image J软件采集信号绘制CAS9蛋白质的标准曲线,进而对水稻叶片中的CAS9蛋白质进行定量分析。提取单粒稻米的总蛋白质,稀释后用免疫印迹分析CAS9蛋白质的检测下限,提取多个时期、部位的水稻材料的总蛋白质,包括苗期的地上部和地下部,分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶片等,用SDS-PAGE分离后免疫印迹检测比较CAS9蛋白质的表达特征。【结果】通过体外克隆、诱导表达获得了纯化的重组CAS9蛋白质N端片段,免疫小鼠后得到42株阳性杂交瘤细胞株,经筛选鉴定到#12D2细胞株对水稻样品的检测具有较好的特异性和灵敏度。用该抗体通过免疫印迹检测了转基因水稻,所建立的免疫印迹方法对重组CAS9蛋白质的检测下限约为0.25 ng。在水稻苗期叶片中,CAS9蛋白质约占鲜重的0.00005%,可检出单粒稻米8%样品(约2 mg)中的CAS9蛋白质。在苗期地上部CAS9蛋白质的表达丰度高于地下部,分蘖期茎和叶片中表达量较高,根和叶鞘表达量较低。【结论】获得特异性强、灵敏度高的抗CAS9单克隆抗体,建立了检测转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印记方法,揭示了CAS9蛋白质在水稻不同部位的表达特征,并展示了在其他植物中的应用潜力。 展开更多
关键词 水稻 转基因植物 CAS9蛋白质 单克隆抗体 免疫印迹
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基于抗体的水稻蛋白质组学理论与实践
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作者 刘国振 李莉云 +58 位作者 窦世娟 杨明 李晓明 张剑硕 侯明明 曹英豪 刘丽娟 魏健 郭亚璐 史佳楠 陈悦 王田幸子 范伟 张柳 马金姣 张彤 刘玉晴 燕高伟 徐珊 杨烁 周艳 杜铁民 牛东东 荣瑞娟 黄腾 柴帅杰 郭美岑 缪刘杨 李雪姣 徐文静 关明俐 贾霖 贾盟 曾祥然 高庆华 刘钊 王宪云 刘雨萌 兰金苹 白辉 刘斯奇 尹长城 吴琳 韦汉福 韩宇宁 赵丽英 杨春霞 武鹏程 马晓飞 赵志静 潘秦 郝育杰 陈浩 赵磊 康昊翔 耿广荟 孔令男 史晓儒 奚文辉 《中国科技成果》 2022年第24期10-11,共2页
水稻是最重要的粮食作物之一,不仅是世界上一半以上的人口以水稻作为主粮,也是基础研究的模式植物。项目团队在前人研究的基础上,结合蛋白质研究的需求和发展趋势,凝练提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念,十多年来,不断优化技术路... 水稻是最重要的粮食作物之一,不仅是世界上一半以上的人口以水稻作为主粮,也是基础研究的模式植物。项目团队在前人研究的基础上,结合蛋白质研究的需求和发展趋势,凝练提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念,十多年来,不断优化技术路线,积极拓展和丰富相关理论并开展实践。1主要创新点1.1首次提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念。 展开更多
关键词 蛋白质组学 结合蛋白质 理论与实践 项目团队 主要创新点 开展实践 发展趋势 抗体
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