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含编码人乳头瘤病毒18型L1蛋白基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的条件优化 被引量：1
1
作者 丁军颖 张振龙 +4 位作者 孙丽媛 刘君 张夕燕 于世荣 许雪梅 《国际生物制品学杂志》 CAS 2009年第2期68-70,共3页
目的确定以昆虫细胞sf9F增含编码人乳头瘤病毒（human papillomavims，HPV）18型L1蛋白（HPV18L1）基因的杆状病毒以及相应蛋白表达的最佳条件。方法以对数生长期的sf9细胞在不同感染复数（M01）和不同时间条件下扩增病毒，以蚀斑试验... 目的确定以昆虫细胞sf9F增含编码人乳头瘤病毒（human papillomavims，HPV）18型L1蛋白（HPV18L1）基因的杆状病毒以及相应蛋白表达的最佳条件。方法以对数生长期的sf9细胞在不同感染复数（M01）和不同时间条件下扩增病毒，以蚀斑试验检测病毒滴度，选择获得最高滴度病毒的最佳条件；再以sf9细胞在不同细胞密度、不同MOI值和不同时间条件下表达相应蛋白，以蛋白印迹法鉴定并比较不同条件下的蛋白表达量，选择获得最大量目的蛋白的最佳条件。结果对数生长期的sf9细胞在MOI值为0．50、扩增时间为48h时，所扩增的病毒滴度最高，可达3×10^8pfu／ml；在细胞密度为3×10^6／ml、MOI值为2．0、表达时间为72h时，所表达的蛋白量最大，约5mg/L。结论确定了含编码HPV18L1基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的最佳条件。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18 L1基因 杆状病毒 昆虫细胞 病毒样颗粒
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重组人乳头瘤病毒11型L1蛋白在昆虫细胞sf9中的表达条件优化研究
2
作者 刘君 张夕燕 +4 位作者 孙丽媛 于世荣 丁军颖 许雪梅 张振龙 《国际生物制品学杂志》 CAS 2009年第5期231-233,共3页
目的确定利用昆虫细胞一杆状病毒表达系统表达重组人乳头瘤病毒11型L1蛋白（HPV11 L1）的最适表达条件。方法通过间接免疫荧光法鉴定目的蛋白表达情况；用蛋白印迹法（Western blot）确定在不同感染复数（MOI）、不同表达时间条件下目... 目的确定利用昆虫细胞一杆状病毒表达系统表达重组人乳头瘤病毒11型L1蛋白（HPV11 L1）的最适表达条件。方法通过间接免疫荧光法鉴定目的蛋白表达情况；用蛋白印迹法（Western blot）确定在不同感染复数（MOI）、不同表达时间条件下目的蛋白的最适表达条件。结果当sf9细胞密度为2．0×10^6／ml时，以MOI值为2．0的重组杆状病毒接种，悬浮表达96h收获为最适表达条件。结论确定了目的蛋白的最适表达条件，为进一步大量表达及纯化提供参考。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒11 荧光免疫测定 L1蛋白 昆虫细胞 表达
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重组人睫状神经营养因子纯化工艺的建立 被引量：2
3
作者 刘君 蔡觅 +3 位作者 郑秀玉 张夕燕 王健 张振龙 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第12期1321-1327,共7页
目的建立适于生产应用的重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rh CNTF)纯化工艺,并对纯化产物进行鉴定。方法将CNTFnew CC22突变体工程菌BL21(DE3)菌体破碎上清经25%饱和度硫酸铵沉淀后,沉淀上清先后... 目的建立适于生产应用的重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rh CNTF)纯化工艺,并对纯化产物进行鉴定。方法将CNTFnew CC22突变体工程菌BL21(DE3)菌体破碎上清经25%饱和度硫酸铵沉淀后,沉淀上清先后经Butyl HP疏水层析和Q HP阴离子交换层析进行纯化。通过非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)检测样品纯度;质谱法测定rh CNTF的相对分子质量;Edman化学降解法测定rh CNTF的N-端氨基酸序列;TF-1细胞/CCK-8比色法和对饮食诱导性肥胖(diet-induced obesity,DDIO)大鼠的减肥作用分别测定rh CNTF的体外和体内生物学活性。结果纯化后rh CNTF的纯度可达99.6%,纯化回收率为34.5%;相对分子质量为21 153;N-端15个氨基酸序列为Ala-Phe-Thr-Glu-His-Ser-Pro-Leu-Thr-Pro-His-Arg-Arg-Asp-Leu;生物学比活性高于2×106 IU/mg,并能有效降低DIO大鼠体重。结论经3步纯化成功获得了高纯度的rh CNTF,为进一步对其性质、功能和生产应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 重组人睫状神经营养因子 纯化 大肠埃希菌 减肥
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重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白在昆虫细胞中的表达及条件优化研究 被引量：2
4
作者 孙丽媛 刘君 +3 位作者 张夕燕 丁军颖 张振龙 许雪梅 《国际生物制品学杂志》 CAS 2009年第2期64-67,共4页
目的利用昆虫细胞一杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus16，HPV16）L1蛋白，并确定含编码HPV16L1蛋白基因杆状病毒的扩增及其相应目的蛋白表达的最佳条件。方法在不同感染复数（MOI）、不同时间条件下扩增病... 目的利用昆虫细胞一杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus16，HPV16）L1蛋白，并确定含编码HPV16L1蛋白基因杆状病毒的扩增及其相应目的蛋白表达的最佳条件。方法在不同感染复数（MOI）、不同时间条件下扩增病毒，以蚀斑试验检测病毒滴度，研究获得最高滴度病毒的最适条件；通过对相应蛋白进行表达条件的优化，以蛋白印迹法比较蛋白表达量，确定目的蛋白表达的最佳条件。结果确定了扩增含编码HPV16L1蛋白基因杆状病毒及表达相应蛋白的最佳条件，即在sf9细胞系中，以MOI值为0．10接种病毒，扩增48h后收获病毒；以细胞密度为（2—3）×10^6／ml，MOI值为10．0接种病毒，悬浮表达72h收获目的蛋白。蛋白印迹法检测结果证实，表达的目的条带可与HPV16L1蛋白的单克隆抗体发生反应。结论建立了在昆虫细胞中表达HPV16L1蛋白的最适条件，为下一步的纯化及免疫原性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16 L1蛋白 昆虫细胞 表达
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重组人乳头瘤病毒16型L1 VLP的初步纯化、鉴定及免疫效果的初步研究
5
作者 孙丽媛 张婷 +6 位作者 于世荣 陈祥鹏 刘君 李莉莉 张夕燕 张振龙 许雪梅 《国际生物制品学杂志》 CAS 2010年第4期169-172,共4页
目的 对昆虫细胞-杆状病毒系统表达的人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型L1蛋白病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）进行初步纯化研究,并在小鼠中检测纯化VLP的免疫原性.方法 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化方法纯... 目的 对昆虫细胞-杆状病毒系统表达的人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型L1蛋白病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）进行初步纯化研究,并在小鼠中检测纯化VLP的免疫原性.方法 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化方法纯化HPV16 LI VLP.对纯化得到的VLP分别进行蛋白印迹法、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及电镜鉴定.然后用VLP免疫6周龄BALB/c小鼠.将小鼠随机分成6组（3个剂量组、2个佐剂组和1个对照组）,间隔2周免疫3次,3次剂量相同.取血分离血清,采用间接ELISA法检测抗HPV16 L1 VLP抗体滴度.结果 经蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化后,用SDS-PAGE鉴定纯化的HPV16 LI VLP,纯度达到90%.电镜观察可见完整的VLP颗粒.间接EUSA检测结果显示,剂量组及佐剂组小鼠血清中均可检测到特异性抗HPV16 L1 VLP抗体,且抗体滴度随针次和剂量的增加而增高.结论 采用蔗糖-氯化铯密度梯度超速离心纯化法得到的HPV16 L1 VLP可用于免疫学初步研究.通过昆虫细胞表达产生的HPV16 LI VLP 具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强的体液免疫应答. 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16 L1蛋白 病毒样颗粒 纯化 免疫原性
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重组人乳头瘤病毒58型L1蛋白在Sf9细胞中的表达条件优化
6
作者 于世荣 孙丽媛 +4 位作者 刘君 丁军颖 李军 张夕燕 张振龙 《国际生物制品学杂志》 CAS 2010年第3期128-133,共6页
目的 采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统扩增人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）58型L1蛋白基因,确定L1蛋白表达的最佳条件.方法 取处于埘数生长期的S19细胞以不同的感染复数（MOI）值扩增病毒,用噬斑试验检测病毒滴度,确定扩增重... 目的 采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统扩增人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）58型L1蛋白基因,确定L1蛋白表达的最佳条件.方法 取处于埘数生长期的S19细胞以不同的感染复数（MOI）值扩增病毒,用噬斑试验检测病毒滴度,确定扩增重组病毒的最适条件 用间接免疫荧光法判断目的蛋白表达情况 通过蛋白印迹法测定不同的表达时间和MOI值条件下目的蛋白表达量,确定目的蛋白的最佳表达条件.结果 处于对数生长期的细胞以MOI值为0.5表达48 h条件下扩增含HPV58 LI基因的重组杆状病毒,滴度最高,可达5×108pfu/ml 以MOI值为5.0表达72 h获得最佳的目的蛋白表达量.结论 确定了扩增病毒和表达相应目的蛋白的最佳条件. 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 基因表达 重组蛋白质类
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重组人睫状神经营养因子突变体及其聚乙二醇修饰物的制备及其对ob/ob肥胖小鼠体重、糖脂代谢的影响 被引量：1
7
作者 郑秀玉 柳森 +3 位作者 李素贞 张夕燕 晁华 王健 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第12期1361-1369,共9页
目的 制备重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)突变体[rhCNTF(R^6315)]及其聚乙二醇修饰物[P-rhCNTF(R^6315)],探讨两者对ob/ob肥胖小鼠体重及糖脂代谢的影响。方法 采用rhCNTF(R^6315)突变... 目的 制备重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)突变体[rhCNTF(R^6315)]及其聚乙二醇修饰物[P-rhCNTF(R^6315)],探讨两者对ob/ob肥胖小鼠体重及糖脂代谢的影响。方法 采用rhCNTF(R^6315)突变体工程菌株E.coli BL21(DE3)表达rhCNTF(R^6315),经硫酸铵沉淀、Butyl HP和Q HP纯化后采用PEG修饰剂Y-40KD-MAL-mPEG对其C17游离巯基进行定点修饰,经QH P层析纯化获得P-rhCNTF(R^6315)。上述产物进行SDS-PAGE、纯度、修饰率、二级结构表征、修饰位点、体外活性、体内药代动力学检测。将ob/ob小鼠分为P-rhCNTF(R^6315)组(0.05、0.1、0.2 mg/kg)、rhCNTF(R^6315)组及赋形剂组,均采用高脂饲料喂养,同时设C57BL/6J组(普通饲料喂养C57BL/6J小鼠),检测各组小鼠的体重、摄食量及糖脂代谢情况。结果 rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)纯度分别为97.4%和99.3%,平均比活分别为9. 5×10^5和6. 9×10^5 IU/mg,相对比活分别为100%和72.6%;rhCNTF(R6315)修饰率达90%以上,大多数为单修饰产物,PEG修饰未影响rhCNTF(R^6315)的二级结构,修饰位点发生在DLCSR肽段的C17上;P-rh CNTF(R^6315)经皮下及静脉途径给药的血药浓度均在注射后约72 h降至给药前水平。与赋形剂组比较,P-rhCNTF(R^6315)0. 05、0.1、0.2 mg/kg剂量组小鼠在疗程结束时体重组分别减轻了10%、11%和21%(P <0.05),rh CNTF(R^6315)组减轻了30%(P<0.01);治疗后15 d,rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠摄食量明显降低(P<0.05),随后逐渐恢复正常水平;P-rhCNTF(R^6315)各剂量组从给药后8 d起,小鼠随机血糖有所降低,呈一定的量效关系,rhCNTF(R^6315)组从给药后4 d开始有所下降;P-rh CNTF(R^6315) 0.2 mg/kg剂量组和rhCNTF(R^6315)组的口服糖耐量(oral glucose resistant test,OGTT)曲线下面积(AUC0~2 h)及腹腔内脂肪重量显著降低(P<0.05),rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠皮下脂肪均显著降低(P<0.01)。结论 制备了较高纯度的rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315),两者对ob/ob肥胖小鼠的体重过高、高血糖症,体脂重量过高均具有良好的疗效,且P-rhCNTF(R^6315)更长效。 展开更多
关键词 重组人睫状神经营养因子 突变体工程菌 定点聚乙二醇修饰 肥胖 脂肪代谢 糖代谢
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