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结合CRISPR/Cas12b与LAMP技术的乳粉中克罗诺杆菌属的检测 被引量:1
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作者 张懿翔 张清平 刘洋 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2023年第12期54-58,共5页
将CRISPR/Cas12b与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法相结合,应用于乳粉中克罗诺杆菌属的检测。通过基因组比较寻找克罗诺杆菌菌株基因内部的候选保守序列,针对克罗诺杆菌属特异性关键基因序列设计L... 将CRISPR/Cas12b与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法相结合,应用于乳粉中克罗诺杆菌属的检测。通过基因组比较寻找克罗诺杆菌菌株基因内部的候选保守序列,针对克罗诺杆菌属特异性关键基因序列设计LAMP引物和向导RNA靶向序列,对其进行条件优化、特异性检测,并用人工污染样品对体系的灵敏度、重复性进行验证。结果表明该方法具有良好的特异性,方法的灵敏度达到了0.1 pg/μL;人工污染样品可检测到初始菌量<10 CFU/g的样品,方法检出限为<10 CFU/100 g。将该方法应用于51份市售乳粉样品以及52份模拟生产环境样品的检测,结果与传统国标方法一致,并且大幅缩短了实验时间。该方法可用于乳粉中克罗诺杆菌属的快速检测。 展开更多
关键词 CRISPR Cas12b 克罗诺杆菌属 环介导等温扩增
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运用统计学方法对能力验证定性样品的均匀性和稳定性进行评价 被引量:6
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作者 顾文佳 张懿翔 +2 位作者 许超 葛宇 曲勤凤 《食品安全质量检测学报》 CAS 2019年第21期7138-7141,共4页
目的使用统计方法客观评价定性能力验证样品的均匀性和稳定性。方法使用荧光PCR法分别检测每组样品中牛、羊、鸭源性成分,对阳性结果的Ct值进行单因素方差分析,评定样品的均匀性。采用线性回归方法,评定样品的稳定性。结果 F<F0.05(9... 目的使用统计方法客观评价定性能力验证样品的均匀性和稳定性。方法使用荧光PCR法分别检测每组样品中牛、羊、鸭源性成分,对阳性结果的Ct值进行单因素方差分析,评定样品的均匀性。采用线性回归方法,评定样品的稳定性。结果 F<F0.05(9,10)=3.02且P>0.05,各组样品间无显著性差异,样品是均匀的。线性回归分析结果直线斜率无统计学差异,即样品在检测期间保持稳定。结论运用统计学方法对动物成分能力验证样品的均匀性和稳定性进行定量分析,能够更科学地对能力验证样品的均匀性和稳定性进行统计学推断。 展开更多
关键词 能力验证 均匀性和稳定性 动物成分
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几种提取转基因木瓜DNA方法的比较 被引量:2
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作者 许超 曲勤凤 +4 位作者 顾文佳 庞贝妮 张懿翔 张奕南 俞漪 《食品安全质量检测学报》 CAS 2016年第4期1531-1534,共4页
目的比较CTAB法、SDS法及试剂盒法分别提取木瓜果皮、果肉、种籽DNA的效果,以提高转基因木瓜的检测准确率。方法对转基因木瓜内源基因Papain及外源基因NPTII、CP进行普通PCR,同时对基因表达零件Ca MV35S启动子和NOS终止子进行荧光PCR,... 目的比较CTAB法、SDS法及试剂盒法分别提取木瓜果皮、果肉、种籽DNA的效果,以提高转基因木瓜的检测准确率。方法对转基因木瓜内源基因Papain及外源基因NPTII、CP进行普通PCR,同时对基因表达零件Ca MV35S启动子和NOS终止子进行荧光PCR,以检测提取DNA的质量。结果分析电泳产物发现,SDS法提取木瓜种籽样品的DNA未能适合普通PCR检测的要求,其他方法均能满足普通PCR要求。荧光PCR结果显示,3种方法提取的DNA都满足荧光扩增要求。结论比较3种提取方法及3种木瓜材料,发现用CTAB法或SDS法以果皮为材料提取DNA质量最佳。 展开更多
关键词 木瓜 CTAB法 SDS法 试剂盒法 DNA提取 荧光PCR
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食品过敏原牡蛎成分PCR检测方法的初步研究 被引量:3
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作者 张懿翔 曲勤凤 +3 位作者 余顺吉 胡雪莲 熊薇 葛宇 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2019年第2期251-256,共6页
目的:建立基于PCR技术的过敏原牡蛎成分快速检测方法,结合溶解曲线及特异的Tm值与Ct值,用于不同产品的牡蛎成分检测。方法:根据NCBI上的牡蛎线粒体序列,通过DNA Star等软件设计引物,分别采用普通PCR和SYBR Green I实时荧光PCR的方法建... 目的:建立基于PCR技术的过敏原牡蛎成分快速检测方法,结合溶解曲线及特异的Tm值与Ct值,用于不同产品的牡蛎成分检测。方法:根据NCBI上的牡蛎线粒体序列,通过DNA Star等软件设计引物,分别采用普通PCR和SYBR Green I实时荧光PCR的方法建立食品过敏原牡蛎成分的检测方法,对十种牡蛎阳性样品和二十余种阴性样品进行实验,并且对几种牡蛎相关食品进行检测。结果:研究建立的检测方法可以检测出含牡蛎成分0.1%的样品,其中荧光PCR的灵敏度达到0.01 ng/μL,特征峰的Tm温度为80.08℃,能够检测出牡蛎相关食品中的牡蛎成分。结论:该方法是一种操作安全方便、成本较低、特异、灵敏的实时荧光PCR方法,对于收集到的食品相关产品以及保健品中牡蛎粉的检出率为100%,该方法可广泛应用于食品中牡蛎成分的快速鉴定。 展开更多
关键词 食品过敏原 牡蛎成分 PCR 定性检测
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上海市肉制品中动物源性成分检测能力验证研究 被引量:3
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作者 顾文佳 许超 +4 位作者 陆壹 张懿翔 郑蓉 曲勤凤 葛宇 《食品安全质量检测学报》 CAS 2019年第7期1987-1993,共7页
目的了解上海市获得资质的各实验室动物源性成分检测的能力。方法按照能力验证活动的实施方案进行样品制备、样品均匀性和稳定性、发样检测、结果统计等,并对能力验证结果进行分析。结果共12家实验室参加了本次能力验证活动并及时反馈... 目的了解上海市获得资质的各实验室动物源性成分检测的能力。方法按照能力验证活动的实施方案进行样品制备、样品均匀性和稳定性、发样检测、结果统计等,并对能力验证结果进行分析。结果共12家实验室参加了本次能力验证活动并及时反馈了检测结果,其中10家实验室的所有结果都满意,满意率为83.3%; 2家实验室的6个项次初测结果不满意,占参加总数的16.7%。复测结果均满意。结论通过本次能力验证了解了这12家实验室具备动物源性成分检测的基本能力。通过外部的现场核查和样品检测可大大提升实验室的能力。 展开更多
关键词 肉制品 动物源性成分 能力验证
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环介导等温扩增技术快速检测食品过敏原牡蛎成分 被引量:11
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作者 张懿翔 于媛媛 +3 位作者 宋春宏 李妍 熊薇 葛宇 《食品安全质量检测学报》 CAS 2019年第7期1804-1810,共7页
目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法快速检测食品中的过敏原牡蛎成分。方法根据国家生物技术信息中心的牡蛎线粒体序列,通过Primer Explorer version 5.0软件设计引物并筛选出LAMP特异性扩增引... 目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法快速检测食品中的过敏原牡蛎成分。方法根据国家生物技术信息中心的牡蛎线粒体序列,通过Primer Explorer version 5.0软件设计引物并筛选出LAMP特异性扩增引物。并进一步对反应体系优化,对该方法的灵敏度、特异性以及稳定性进行验证。对10种牡蛎阳性样品、14种阴性样品、4类牡蛎相关食品进行检测。结果该方法可以检测出含牡蛎成分0.1%, DNA浓度为0.01 ng/μL的样品。在实验时间上大幅缩短,反应可在25~45 min内结束,并且可以在微量体系下完成,对于食品相关产品的检出率为100%。结论该方法操作简单、成本较低、特异性高、灵敏度好,适用于食品中过敏原牡蛎成分的检测。 展开更多
关键词 食品过敏原 牡蛎成分 环介导等温扩增技术
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婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌增菌培养对PCR快速检测的影响 被引量:5
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作者 张清平 张懿翔 刘洋 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2021年第11期9-12,共4页
通过人工染菌方法,比较添加不同奶粉基质、不同初始菌量、不同增菌培养时间及添加不同干扰菌的情况下,阪崎肠杆菌的生长增殖变化,研究适合阪崎肠杆菌快速检测的最佳增菌时间。随着初始菌量的降低,阪崎肠杆菌生长延滞期延长,当初始菌量为... 通过人工染菌方法,比较添加不同奶粉基质、不同初始菌量、不同增菌培养时间及添加不同干扰菌的情况下,阪崎肠杆菌的生长增殖变化,研究适合阪崎肠杆菌快速检测的最佳增菌时间。随着初始菌量的降低,阪崎肠杆菌生长延滞期延长,当初始菌量为1~9CFU/1 000 mL,阪崎肠杆菌增殖到10^(3)CFU/mL约需要10 h;含有奶粉基质的增菌液中目标菌增殖速度低于未添加奶粉的增菌液中的增殖速度;采用荧光PCR方法检测添加干扰菌后的阪崎肠杆菌的生长情况,含有大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的增菌液在培养10 h可以检出阪崎肠杆菌,而添加阴沟肠杆菌的BPW增菌液需培养12 h能检出阪崎肠杆菌。因此,对幼儿乳粉增菌培养12 h后,对其增菌液进行PCR检测,即可快速且有效地检出阪崎肠杆菌。 展开更多
关键词 阪崎肠杆菌 快速检测 增菌培养 初始菌量
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同源重组整合vgb基因提升枯草芽孢杆菌亚麻脱胶能力 被引量:3
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作者 张懿翔 丁若垚 +2 位作者 陈婷 郁崇文 张兴群 《中国麻业科学》 2015年第2期87-94,共8页
【目的】将透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgb)在枯草芽孢杆菌中进行整合表达,以改善枯草芽孢杆菌的呼吸强度,通过高密度培养提高果胶酶的表达量,最终明显改善脱胶效果。【方法】构建含有vgb基因、amy E基因以及启动子P43的p SK-vgb(+)质粒... 【目的】将透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgb)在枯草芽孢杆菌中进行整合表达,以改善枯草芽孢杆菌的呼吸强度,通过高密度培养提高果胶酶的表达量,最终明显改善脱胶效果。【方法】构建含有vgb基因、amy E基因以及启动子P43的p SK-vgb(+)质粒,通过同源重组的方法,将vgb基因整合到枯草芽孢杆菌A5的染色体上,得到稳定表达透明颤菌血红蛋白的枯草芽孢杆菌A5-vgb(+)。分别采用PCR和CO差光谱分析法检测vgb基因的整合状态与血红蛋白的稳定表达,并通过发酵摇瓶试验研究VHb对菌株果胶酶产量的影响。将构建好的A5-vgb(+)菌株进行脱胶试验,通过XRD结晶度与电镜扫描分析鉴定脱胶效果。【结果】PCR与CO差光谱检测表明,vgb基因成功整合在A5菌株中,且正确表达的VHb具有生物学活性,在150 rpm,37℃,p H=8.0,16小时发酵的条件下,vgb基因的表达促使A5-vgb(+)菌株的果胶酶产量较不含vgb基因的菌株提升了29.5%。XRD与电镜扫描结果表明,构建的A5-vgb(+)菌株的脱胶效果相较于不含vgb的菌株,在结晶度上提高了0.55%,表面更光滑。【结论】将vgb基因整合至枯草芽孢杆菌A5菌株中,可提高A5菌株的脱胶效果。 展开更多
关键词 生物脱胶 果胶酶 枯草芽孢杆菌 VGB基因 同源重组
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基于CRISPR/Cas12b的乳粉中克罗诺杆菌属检测 被引量:1
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作者 张懿翔 张清平 +3 位作者 李林显 王亮 杨捷琳 刘洋 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第6期267-275,共9页
目的:开发一种基于CRISPR/Cas12b的克罗诺杆菌属分子检测方法。方法:以克罗诺杆菌菌属特异性基因序列为候选区域,针对区域设计扩增引物和向导RNA靶向序列,对其进行条件优化、特异性检测、反应体系优化,并用人工污染样品对体系的灵敏度... 目的:开发一种基于CRISPR/Cas12b的克罗诺杆菌属分子检测方法。方法:以克罗诺杆菌菌属特异性基因序列为候选区域,针对区域设计扩增引物和向导RNA靶向序列,对其进行条件优化、特异性检测、反应体系优化,并用人工污染样品对体系的灵敏度、重复性进行验证。结果:该方法的特异性很好,方法的灵敏度达0.01 ng/μL,在人工污染样品中可检测到初始菌量<10 CFU/g的样品,方法检出限<10 CFU/100 g。对市售的51份乳粉样品进行检测,结果与传统国标方法一致。结论:建立的CRISPR/Cas12b方法可用于乳粉中克罗诺杆菌属的快速检测。 展开更多
关键词 CRISPR Cas12b 克罗诺杆菌属 检测
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水培生菜培育、运输、贮存各环节微生物的动态变化研究 被引量:1
10
作者 宋春宏 顾文佳 +4 位作者 张懿翔 刘康 赵燕 张样平 葛宇 《食品安全质量检测学报》 CAS 2020年第9期2963-2968,共6页
目的探究水培生菜在培育、运输、贮存各环节中微生物数据的动态变化,分析影响水培生菜微生物风险的环节因素。方法对水培生菜在培育过程、运输阶段和贮存阶段的菌落总数、大肠菌群、霉菌等指示菌数据进行跟踪,并于培育的第1周和第7周对... 目的探究水培生菜在培育、运输、贮存各环节中微生物数据的动态变化,分析影响水培生菜微生物风险的环节因素。方法对水培生菜在培育过程、运输阶段和贮存阶段的菌落总数、大肠菌群、霉菌等指示菌数据进行跟踪,并于培育的第1周和第7周对其致病菌进行检测。结果水培生菜在培育过程中菌落总数lg平均值为6.52,标准差0.37,大肠菌群lg平均值为4.78,标准差0.61,霉菌lg平均值为4.01,标准差0.22,基本维持稳定;经常清洗运输工具能有效抑制微生物生长;生菜贮存1 d后微生物指示菌数量显著增多(P<0.05),冷藏贮存生菜有助于减缓微生物指示菌的增长;在第1周和第7周均未对水培生菜检出致病菌。结论水培生菜在生长过程中更容易控制种植环境,微生物污染风险较小。后续的运输环节和储存条件需要严格控制,以降低蔬菜中微生物的污染风险。 展开更多
关键词 培育过程 水培生菜 运输工具 大肠菌群 微生物污染 储存条件 种植环境 运输环节
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等温扩增技术在克罗诺杆菌属快速检测中的研究进展 被引量:1
11
作者 王亮 张懿翔 刘洋 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2021年第6期33-36,共4页
环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶等温扩增技术、滚环扩增技术和依赖解旋酶扩增技术作为常用的4种等温扩增技术,被广泛应用于克罗诺杆菌的快速检测中。通过分析不同技术的原理并以近5年的具体应用为例,从增菌时间、检出限、鉴定时间、... 环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶等温扩增技术、滚环扩增技术和依赖解旋酶扩增技术作为常用的4种等温扩增技术,被广泛应用于克罗诺杆菌的快速检测中。通过分析不同技术的原理并以近5年的具体应用为例,从增菌时间、检出限、鉴定时间、目标菌群、目的基因这几个方面进行系统比较,希望能对企业和监管部门在食品安全控制方面提供相关理论支持。最后提出缩短目标菌富集时间,结果直观易读,多重技术融合将是未来快速检测技术的发展重要方向。 展开更多
关键词 克罗诺杆菌属 等温扩增 快速检测技术
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