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猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究 被引量：3
1
作者 曾苗苗 刘大凯 +8 位作者 张记宇 张燎原 冯廷帅 杨小曼 时洪艳 张鑫 陈建飞 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期61-69,共9页
为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证... 为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 自噬 病毒复制 LC3-Ⅱ
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猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用 被引量：1
2
作者 刘大凯 韩郁茹 +8 位作者 张记宇 张燎原 冯廷帅 杨小曼 曾苗苗 时洪艳 秦毅斌 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期499-504,共6页
为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和... 为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 S蛋白 原核表达 多克隆抗体 初步应用
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猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立
3
作者 杨小曼 时洪艳 +8 位作者 张燎原 张鑫 张记宇 刘大凯 冯廷帅 曾苗苗 陈建飞 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期608-613,共6页
为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析... 为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 S1蛋白 间接ELISA方法 抗体检测
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猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：7
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作者 张记宇 韩郁茹 +9 位作者 时洪艳 陈建飞 张鑫 刘建波 张燎原 冯书风 冯廷帅 季朝阳 石达 冯力 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期2887-2894,共8页
为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品... 为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10^(1)~3.31×10^(7)拷贝·μL^(-1)模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10^(1)拷贝·μL^(-1),组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^(6.7)、10^(5.3)拷贝·mL^(-1)。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征病毒 N基因 荧光定量PCR 检测
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猪急性腹泻综合征冠状病毒RT-LAMP快速检测方法的建立与应用 被引量：7
5
作者 韩郁茹 石达 +5 位作者 张记宇 时洪艳 陈建飞 张鑫 刘建波 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期35-39,共5页
为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RTLAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初... 为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RTLAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初步建立SADS-CoV的RT-LAMP快速检测方法。利用该方法检测SADS-CoV、猪流行性腹泻性病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪肠道病毒9型(PEV9),评估其特异性,结果显示除SADS-CoV外,该方法与其它病原无交叉反应,特异性较强;将病毒RNA 10倍倍比稀释后作为模板,利用该RT-LAMP与普通RT-PCR同时检测,结果显示,RTLAMP方法比普通RT-PCR方法的敏感性高103倍,敏感性较高。以同一批次或不同批次的SADS-CoV核酸为模板进行RT-LAMP试验,结果显示RT-LAMP批内批间均可稳定的检出阳性样本,表明该方法具有良好的重复性和稳定性。对经口服感染SADS-CoV和未感染仔猪的临床样本进行检测,结果显示RT-LAMP与普通RT-PCR检测结果高度一致。本实验首次建立的SADS-CoV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高,操作简便、快速和高通量检测的优点,为临床SADS-CoV感染的快速诊断和综合防控提供检测手段。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征病毒 N基因 反转录-环介导恒温扩增技术 快速检测
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甘草酸通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抗猪急性腹泻综合症冠状病毒感染的研究 被引量：2
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作者 冯书风 时洪艳 +8 位作者 张记宇 陈建飞 张鑫 张燎原 冯廷帅 景朝阳 季朝阳 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1076-1083,共8页
猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠... 猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠上皮细胞(IPI-2I)预处理2 h并感染不同浓度的SADS-CoV后,分别经western blot和TCID_(50)检测,结果显示N蛋白的表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在体外能够抑制SADS-CoV的感染。利用不同浓度GLY对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后,感染灭活的SADS-CoV,western blot结果显示在GLY浓度为0.8 mmol/L时,N蛋白表达量显著减少,表明GLY能够抑制该病毒的侵入。选取0.4 mmol/L GLY处理细胞,再感染SADS-CoV后2 h、6 h、12 h收取细胞样品经western blot检测,结果显示各时间点N蛋白表达量均显著减少,表明GLY对该病毒的复制抑制效果显著。GLY是高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的竞争性抑制剂,而HMGB1的受体主要有TLR4和RAGE,因此构建了HMGB1关键性位点(C^(45)S、C^(106)S、C^(45/106)S)突变的质粒和RAGE受体的siRNA,分别转染Vero E6细胞并感染SADS-CoV,收获上清液和细胞样品,利用western blot和TCID_(50)检测。结果显示,N蛋白表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在SADS-CoV感染时通过影响HMGB1与TLR4和RAGE的结合而发挥功能。为了进一步探究GLY发挥作用的信号通路,分别将SADS-CoV感染Vero E6和IPI-2I细胞,收获细胞样品,利用western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的变化,结果显示p-p38、p-JNK、p-ERK表达量在感染早期和晚期上调,表明SADS-CoV感染激活了MAPK通路。利用不同浓度的GLY和TLR4抑制剂TAK对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后感染SADS-CoV,收获蛋白样品,western blot结果显示p-JNK和N蛋白表达量显著减少,其他蛋白无明显变化,表明GLY和TAK调控JNK的磷酸化,而不能调控p38和ERK的磷酸化。利用HMGB1中和抗体预处理Vero E6细胞、将HMGB1的siRNA以及构建的HMGB1关键位点突变的真核表达质粒分别转染Vero E6细胞后感染SADS-CoV,收获上述细胞样品,western blot结果显示p-JNK的表达量均减少,表明HMGB1影响了JNK的磷酸化;利用不同浓度的JNK抑制剂SP600125对Vero E6和IPI-2I预处理2 h,再感染SADS-CoV,利用western blot、TCID_(50)和IFA检测,结果显示N蛋白表达量及病毒滴度均下降且病毒复制减少,表明SP600125抑制了病毒的复制。综上所述,本研究首次证实GLY主要通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抑制SADS-CoV的体外复制,该通路的发现为研究抗SADS-CoV的新型药物提供了数据支持。 展开更多
关键词 甘草酸 猪急性腹泻综合症冠状病毒感染 高迁移率蛋白B1 JNK
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