旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP6基因节段,并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blo...旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP6基因节段,并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blot验证该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应。将该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,Western blot和间接免疫荧光验证阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与RVA的反应性。经3轮亚克隆最终获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9,其分泌的单抗亚类为IgG1,轻链类型为Kappa,制备的小鼠腹水效价可达1∶4096000,能够与不同基因型的RVA反应,同时不与常见的猪腹泻相关病毒反应,为未来猪RVA相关基础研究、临床血清学检测方法的开发奠定了基础。展开更多
为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响,以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,PCR扩增出FILIP1L基因,克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因,通...为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响,以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,PCR扩增出FILIP1L基因,克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因,通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果:成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒,转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后,FILIP1L基因的mRNA表达显著上调;过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制;下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上,FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制,研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。展开更多
【目的】猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构...【目的】猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素(cat)选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H(△IMPDH)对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H(△IMPDH))对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H(△IMPDH),并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。展开更多
文摘旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP6基因节段,并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blot验证该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应。将该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,Western blot和间接免疫荧光验证阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与RVA的反应性。经3轮亚克隆最终获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9,其分泌的单抗亚类为IgG1,轻链类型为Kappa,制备的小鼠腹水效价可达1∶4096000,能够与不同基因型的RVA反应,同时不与常见的猪腹泻相关病毒反应,为未来猪RVA相关基础研究、临床血清学检测方法的开发奠定了基础。
文摘为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响,以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,PCR扩增出FILIP1L基因,克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因,通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果:成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒,转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后,FILIP1L基因的mRNA表达显著上调;过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制;下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上,FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制,研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。
文摘【目的】猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素(cat)选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H(△IMPDH)对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H(△IMPDH))对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H(△IMPDH),并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。
