人原代呼吸道上皮细胞培养及抗呼吸道合胞病毒活性

1

作者 丁惠如 赵敏 +5 位作者 程宁宁 付远辉 彭向雷 虞结梅 郑妍鹏 何金生 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期20-25,共6页

为建立人原代呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell,hAEC)的培养方法,并在hAEC体系上探讨3-硫代吲哚类化合物RSV-A-4和免疫抑制剂代谢产物6-MMPr的抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)活性及其机制,从而构建可用... 为建立人原代呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell,hAEC)的培养方法,并在hAEC体系上探讨3-硫代吲哚类化合物RSV-A-4和免疫抑制剂代谢产物6-MMPr的抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)活性及其机制,从而构建可用于RSV药物筛选及药效评价的细胞模型。采集人呼吸道上皮细胞样本,分离细胞后建立hAEC的培养方法,并进行细胞形态和活力鉴定;在hAEC体系上检测小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其细胞毒性;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Time-of-addition assay技术,探讨RSV-A-4和6-MMPr的抑制RSV复制的作用机制。培养的hAEC经鉴定:其体外培养存活率可达93.51%;RSV-A-4和6-MMPr的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为(207.30±4.77)μmol/L和(3191.00±6.11)μmol/L,6-MMPr的半数细胞毒性浓度(Half maximal cytotoxic concentration,CC_(50))为(95526.00±10.97)μmol/L,而RSV-A-4对hAEC未见明显细胞毒性;RSV-A-4和6-MMPr均在RSV病毒基因组复制阶段抑制RSV复制。成功建立可用于抗RSV药物筛选及体外评价的hAEC培养体系,RSV-A-4和6-MMPr在细胞水平均能有效抑制RSV复制。 展开更多

关键词 人原代呼吸道上皮细胞 呼吸道合胞病毒 抗病毒化合物 抗病毒活性 抗病毒机制

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人呼吸道合胞病毒疫苗研发的突破及挑战

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作者 虞结梅 郑妍鹏 +2 位作者 彭向雷 付远辉 何金生 《中国食品药品监管》 2023年第12期64-73,共10页

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)已被发现60余年。在经历了20世纪60年代RSV疫苗研发失败后,基于融合前融合糖蛋白(prefusion fusion glycoprotein,preF)的RSV结构性疫苗目前已取得突破性进展,通过接种孕妇和6... 人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)已被发现60余年。在经历了20世纪60年代RSV疫苗研发失败后,基于融合前融合糖蛋白(prefusion fusion glycoprotein,preF)的RSV结构性疫苗目前已取得突破性进展,通过接种孕妇和60岁以上老年人群,为新生儿及老年人群提供有效保护,从而解决了预防RSV感染“无苗可用”的历史难题。2023年是RSV疫苗研发的里程碑,也将成为新的起点。在此背景下,本文系统介绍了RSV疫苗研发进展、面临的挑战及今后的发展方向,提出针对RSV不同易感人群应采用不同疫苗形式的科学依据及对策,并对RSV感染重点人群(如血清学阴性婴幼儿等低龄儿童)的疫苗研发难点及候选疫苗形式进行了全面分析。结合基于RNA病毒反向遗传学技术的RSV减毒活疫苗(live-attenuated vaccine,LAV)研发设计、临床试验数据及黏膜疫苗优势,笔者认为RSV LAV是预防6个月及以上婴幼儿和低龄儿童RSV感染的前景较好的候选疫苗,有望为RSV疫苗研发带来新突破。此外,本文就如何加强我国RSV疫苗研发提出建议。 展开更多

关键词 人呼吸道合胞病毒 融合前融合糖蛋白 亚单位疫苗 疾病增强作用 减毒活疫苗

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大豆异黄酮研究进展(综述) 被引量：33

3

作者 彭向雷 王蕊 +1 位作者 王悦 崔洪斌 《中国食品卫生杂志》 1998年第3期39-42,共4页

大豆异黄酮研究进展（综述）彭向雷１王蕊２王悦３崔洪斌１１哈尔滨医科大学公卫学院（１５０００１）２哈尔滨市南岗区生防疫站（１５０００１）３黑龙江省海林市立医院（１５７１２３）近年来，西方膳食结构引起的肿瘤、心脑血管等疾... 大豆异黄酮研究进展（综述）彭向雷１王蕊２王悦３崔洪斌１１哈尔滨医科大学公卫学院（１５０００１）２哈尔滨市南岗区生防疫站（１５０００１）３黑龙江省海林市立医院（１５７１２３）近年来，西方膳食结构引起的肿瘤、心脑血管等疾病越来越受到关注。研究表明，膳食大... 展开更多

关键词 大豆异黄酮 研究进展 大豆皂甙 增长因子 黑色素瘤 人早幼粒白血病细胞 大豆食品 抑制剂 生理作用 分化诱导

全文增补中

可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备 被引量：11

4

作者 杨兵 何金生 +7 位作者 石长信 张梅 虞结梅 谢灿 陆燕燕 付远辉 彭向雷 洪涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期682-685,共4页

构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV... 构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。 展开更多

关键词 辅助病毒依赖型腺病毒载体 人呼吸道合胞病毒融合蛋白 逆转录聚合酶链式反应 免疫印迹

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用于植物的铜诱导基因表达系统的改进(英文) 被引量：2

5

作者 彭向雷 钟瑾 +3 位作者 梁斌 胡鸢雷 高音 林忠平 《Acta Botanica Sinica》 CSCD 2003年第11期1307-1311,共5页

铜诱导基因表达系统已被用于植物转基因表达的时空调控。它由两部分构成:(1)组成型或器官专一性表达的acel基因编码铜反应性的转录因子;(2)融合启动子控制下的目的基因,融合启动子由含ACE1结合位点的金属反应元件(MRE)连接CaMV 35S(-90-... 铜诱导基因表达系统已被用于植物转基因表达的时空调控。它由两部分构成:(1)组成型或器官专一性表达的acel基因编码铜反应性的转录因子;(2)融合启动子控制下的目的基因,融合启动子由含ACE1结合位点的金属反应元件(MRE)连接CaMV 35S(-90-+8)启动子组成。本实验测试了来自酵母金属硫蛋白基因5',调控区的两个不同的ACE1结合区域在转基因烟草(Nicotiana tabacum L.cv.W38)中的效果。结果表明,与MRE(-148--105)相比,使用MRE(-210--126)的铜诱导系统效率增加50％到100％。在植物生物技术中使用这一系统控制基因性状是很有潜力的。 展开更多

关键词 铜诱导系统 金属反应元件 金属反应转录因子 转基因烟草 表达系统

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大豆中具生理活性物质的研究与开发 被引量：26

6

作者 崔洪斌 刘颖 +1 位作者 陈近利 彭向雷 《大豆通报》 1998年第6期19-20,共2页

大豆是我国人民自古以来非常喜欢食用的粮食作物，人们对其具有的丰富营养元素、优质蛋白质、食用油脂都非常熟知，但是对其中含有的特殊的具生理活性的物质不甚了解。本文仅就我们研究的情况结合国内外资料简述如下：一、大豆皂甙的生... 大豆是我国人民自古以来非常喜欢食用的粮食作物，人们对其具有的丰富营养元素、优质蛋白质、食用油脂都非常熟知，但是对其中含有的特殊的具生理活性的物质不甚了解。本文仅就我们研究的情况结合国内外资料简述如下：一、大豆皂甙的生理活性及研究现状皂甙（Ｓａｐｏｎｉ... 展开更多

关键词 大豆 生理活性物质 大豆皂甙 异黄酮 磷脂

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靶向树突状细胞的呼吸道合胞病毒F重组蛋白的构建与体外活性分析

7

作者 华颖 彭向雷 +3 位作者 付远辉 郑妍鹏 洪涛 何金生 《北京交通大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期127-133,共7页

分析以人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)融合糖蛋白(fusion glycoprotein,F)为抗原靶向DEC205/CD205受体策略对重组F蛋白表达及活性的影响.F蛋白是RSV的重要中和抗原,克隆RSV F蛋白胞外区的编码基因至可识别鼠... 分析以人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)融合糖蛋白(fusion glycoprotein,F)为抗原靶向DEC205/CD205受体策略对重组F蛋白表达及活性的影响.F蛋白是RSV的重要中和抗原,克隆RSV F蛋白胞外区的编码基因至可识别鼠树突状细胞(Dendritic cells,DCs)DEC205受体的单链抗体(single chain antibody of anti-DEC205,scDEC)的C端,构建可表达重组F蛋白(scDECF)的质粒pVAX1/scDECF,Western blot方法检测scDECF的表达,免疫荧光法和流式细胞术检测表达的scDECF与DEC205受体的结合活性.经Western blot证实在pVAX1/scDECF转染的293T细胞成功表达了scDECF.将所获得的细胞培养上清与表达鼠DEC205受体的细胞CHOmDEC205孵育,用免疫荧光和流式细胞术证实:与作为对照的重组F蛋白scISOF相比,所获得的scDECF与CHOmDEC205细胞呈现明显的结合.本研究成功表达了重组蛋白scDECF,且所获得的重组蛋白scDECF具有与表达DEC205受体的细胞特异性结合的活性. 展开更多

关键词 呼吸道合胞病毒 融合糖蛋白 DEC205 树突状细胞 靶向疫苗

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生物学检测中的纳米技术应用

8

作者 丁克俭 彭向雷 孙维敏 《现代科学仪器》 2008年第3期97-100,共4页

近些年来,纳米技术得到了飞速发展,纳米技术在生物领城的应用是目前最为活跃的研究领域之一。本文阐述了纳米金和量子点两种纳米探测技术的工作原理,及其与生物相互作用的机制,介绍了近期它们在生物学检测方面的研究进展,并对纳米技术... 近些年来,纳米技术得到了飞速发展,纳米技术在生物领城的应用是目前最为活跃的研究领域之一。本文阐述了纳米金和量子点两种纳米探测技术的工作原理,及其与生物相互作用的机制,介绍了近期它们在生物学检测方面的研究进展,并对纳米技术在生物学领域的发展进行了展望。 展开更多

关键词 生物检测 纳米金 量子点

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液相色谱-质谱在阿尔茨海默病研究中的应用

9

作者 田士军 彭向雷 +2 位作者 郑妍鹏 何金生 洪涛 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1154-1160,共7页

液相色谱-质谱联用(LC-MS)作为集高效分离与定性定量检测为一体的联用技术,近年来在化学、医学、药学和生物化学等领域获得了长足的发展,特别是由科研领域拓展到临床诊断,开启了疾病诊断技术的新篇章。阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseas... 液相色谱-质谱联用(LC-MS)作为集高效分离与定性定量检测为一体的联用技术,近年来在化学、医学、药学和生物化学等领域获得了长足的发展,特别是由科研领域拓展到临床诊断,开启了疾病诊断技术的新篇章。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),又称老年性痴呆症,是现代社会第四大致死疾病。随着我国人口的快速老龄化,重视对AD的防治是实现健康老龄化以及国民经济持续发展的重要保障之一。本文对LC-MS的新进展进行了简介,并详细综述了近3年来其在AD研究中的应用,以期相关方法获得更好的理解与更多的关注。 展开更多

关键词 液相色谱-质谱 阿尔茨海默病 临床化学 综述

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利用热诱导的位点专一性重组系统在烟草中控制基因表达(英文)

10

作者 陈明 王立霞 +2 位作者 彭向雷 徐惠君 林忠平 《Acta Botanica Sinica》 CSCD 2003年第12期1481-1488,共8页

采用热激启动子Gmhsp17.5C控制Cre定位重组酶介导的DNA删除系统。在这个系统中,在热激启动子控制下的Cre重组酶的表达导致两侧带有相同方向loxp位点的CaMV35S-GUS片段从转基因烟草(Nicotiana tabacum L.cv.W38)的基因组中删除。通过定量... 采用热激启动子Gmhsp17.5C控制Cre定位重组酶介导的DNA删除系统。在这个系统中,在热激启动子控制下的Cre重组酶的表达导致两侧带有相同方向loxp位点的CaMV35S-GUS片段从转基因烟草(Nicotiana tabacum L.cv.W38)的基因组中删除。通过定量PCR的方法鉴定这个转基因系统,显示了这个系统的重组效率。结果显示在两个小时热激处理后转基因烟草中有41%的CaMV35S-GUS片段被删除。由于热激诱导的定点重组系统有容易操作、对热敏感和无背景表达等优点,因此有利于采用这个系统在转基因植物中进行可诱导的基因操作。 展开更多

关键词 重组酶 热激 诱导 基因表达 烟草

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单引物PCR法引入定点突变 被引量：1

11

作者 彭向雷 王烨 +4 位作者 王丽男 苏彦斌 付远辉 郑妍鹏 何金生 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期19-23,共5页

目的:利用单个突变引物,在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pc DNA3.1(+)-F质粒中,通过单次环形PCR在特定序列位置引入定点突变。方法:以双链环状的pc DNA3.1(+)-F质粒DNA为模板,设计分别含有三种目的突变N70Q,I431N,Q270T的三条... 目的:利用单个突变引物,在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pc DNA3.1(+)-F质粒中,通过单次环形PCR在特定序列位置引入定点突变。方法:以双链环状的pc DNA3.1(+)-F质粒DNA为模板,设计分别含有三种目的突变N70Q,I431N,Q270T的三条单引物,分别进行单次PCR。用甲基化DNA特异的限制性内切酶Dpn I处理PCR产物后转化大肠杆菌DH5α,进行克隆筛选,酶切鉴定和测序分析。结果:酶切鉴定结果和测序结果均符合预期,利用单引物PCR法成功在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pc DNA3.1(+)-F质粒DNA中引入了单碱基突变、两个间隔碱基突变及相邻三碱基突变三种目的突变。结论:单引物PCR法解决了常规定点突变方法中多个PCR反应,程序繁琐及突变效率低等问题,是一种简便、快速、有效的基因工程定点突变新方法。 展开更多

关键词 定点突变 单引物 PCR 基因工程

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自噬稳态调控与阿尔茨海默病防治策略 被引量：8

12

作者 张莹 郭舒涵 +2 位作者 房芳 何金生 彭向雷 《生命科学》 CSCD 2014年第4期340-348,共9页

自噬是真核细胞中降解易聚集蛋白质的重要途径,以应激和损伤时更为显著。自噬与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)密切相关,在AD中起到"双刃剑"的作用,与致病性β淀粉样肽(Aβ)和细胞骨架相关tau蛋白的生成和代谢都有密... 自噬是真核细胞中降解易聚集蛋白质的重要途径,以应激和损伤时更为显著。自噬与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)密切相关,在AD中起到"双刃剑"的作用,与致病性β淀粉样肽(Aβ)和细胞骨架相关tau蛋白的生成和代谢都有密切的关系。随着对自噬机制的深入了解,人们发现了自噬在AD病理过程中的调节作用。综述了自噬的基本机制、自噬与AD发病的互作关系以及如何从自噬的信号转导途径入手,调整AD自噬稳态及重平衡,从而探索新的AD治疗性药物靶标。 展开更多

关键词 自噬 阿尔茨海默病 Β淀粉样肽

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DEK蛋白与细胞凋亡的研究进展 被引量：8

13

作者 华颖 胡红刚 彭向雷 《中国科学（C辑）》 CSCD 北大核心 2009年第5期434-440,共7页

DEK蛋白是一种广泛存在于细胞核内的可磷酸化的核蛋白.研究认为DEK蛋白与DNA的特异性结合能够改变与其结合的DNA的拓扑结构,进而影响基因的活性.细胞应激反应与DEK蛋白有潜在的关系,在死亡受体介导的细胞凋亡过程中,DEK蛋白的磷酸化状... DEK蛋白是一种广泛存在于细胞核内的可磷酸化的核蛋白.研究认为DEK蛋白与DNA的特异性结合能够改变与其结合的DNA的拓扑结构,进而影响基因的活性.细胞应激反应与DEK蛋白有潜在的关系,在死亡受体介导的细胞凋亡过程中,DEK蛋白的磷酸化状态发生了变化.DEK蛋白的磷酸化、多聚腺苷化均能促使DEK蛋白从染色质上释放下来并最终到达细胞外成为导致某些自身免疫性疾病的抗原.近来研究显示,DEK蛋白与细胞凋亡密切相关,DEK蛋白的过表达对细胞凋亡的作用具有双重性,即促进或抑制细胞凋亡. 展开更多

关键词 DEK 细胞凋亡 磷酸化 多聚腺苷化 p53 CASPASE

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人呼吸道合胞病毒感染的A549细胞中长链非编码RNA表达谱研究 被引量：2

14

作者 刘美琴 高博 +6 位作者 焦月盈 李玮 虞结梅 彭向雷 郑妍鹏 付远辉 何金生 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期7-13,共7页

目的:探讨人呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)感染A549细胞的长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)表达谱的差异,更好地了解宿主与RSV之间的相互作用的可能分子机制。方法:1 MOI RSV感染A549细胞,24h后... 目的:探讨人呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)感染A549细胞的长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)表达谱的差异,更好地了解宿主与RSV之间的相互作用的可能分子机制。方法:1 MOI RSV感染A549细胞,24h后提取RNA,利用Agilent的lncRNA表达谱芯片,筛查了RSV感染和未感染的A549细胞中的lncRNA差异表达谱,并进行实时定量PCR验证,通过GO和KEGG对差异mRNA和lncRNA进行生物信息学分析。结果:RSV感染的A549细胞与未感染的A549细胞相比,共有1463个lncRNA和1552个mRNAs显著上调,有944个lncRNA和1489个mRNAs下调,差异表达lncRNA及其预测靶基因主要富集于免疫应答过程。通过定量PCR证实所选lncRNA的表达谱结果。结论:RSV感染A549细胞后,lncRNA表达谱发生明显变化,对深入研究lncRNA如何参与RSV与宿主之间的相互作用奠定了基础。 展开更多

关键词 人呼吸道合胞体病毒 A549细胞 长链非编码RNA 表达谱

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DEK蛋白C末端DNA结合域的原核表达、纯化及其与DNA的结合活性 被引量：1

15

作者 华颖 胡红刚 彭向雷 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期14-18,共5页

DEK蛋白C末端DNA结合域(简称CDB)是近年新发现的一个DEK蛋白与DNA的结合域,其中含有多个磷酸化位点,与DEK蛋白的功能密切相关。利用原核表达系统表达DEK蛋白的CDB肽段并进行纯化,具体为以pET-30a(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细... DEK蛋白C末端DNA结合域(简称CDB)是近年新发现的一个DEK蛋白与DNA的结合域,其中含有多个磷酸化位点,与DEK蛋白的功能密切相关。利用原核表达系统表达DEK蛋白的CDB肽段并进行纯化,具体为以pET-30a(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建重组基因工程菌,以IPTG诱导目的蛋白的表达,用Ni-NTA纯化的重组蛋白样品来进行SDSPAGE电泳分析,约在10.7kDa处出现明显的特征蛋白条带。凝胶迁移分析证实DEK蛋白C末端DNA结合域与DNA的结合倾向于与超螺旋型DNA相结合,同全长的DEK蛋白与DNA的结合具有类似的特点,表明DEK蛋白C末端DNA结合域在DEK蛋白与DNA的结合中可能具有一定的作用。 展开更多

关键词 DEK蛋白 C末端DNA结合域 原核表达 纯化 凝胶迁移实验

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基于T7启动子表达系统的呼吸道合胞病毒微型基因组的拯救 被引量：2

16

作者 袁锐 付远辉 +5 位作者 何金生 焦月盈 蒋桂云 张梅 彭向雷 阚学通 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期1-9,共9页

目的:以T7启动子表达系统为基础,通过RNA病毒反向遗传学操作,拯救人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)微型基因组。方法:构建可分别表达RSV四种核壳体蛋白的辅助质粒px8δT-PT1-N,px8δT-PT1-P,px8δT-PT1-M2-1和... 目的:以T7启动子表达系统为基础,通过RNA病毒反向遗传学操作,拯救人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)微型基因组。方法:构建可分别表达RSV四种核壳体蛋白的辅助质粒px8δT-PT1-N,px8δT-PT1-P,px8δT-PT1-M2-1和px8δT-PT1-L以及含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein,EGFP)开放读码框(open reading frame,ORF),RSV病毒前导序列(leader region/genomic promotor),转录起始信号(gene start,GS)、转录终止信号(gene end,GE)和尾随序列(trailer region/antigenomic promoter)等顺式作用元件(cis-acting elements)的微型基因组重组质粒pSC11-E,在上述的5个质粒中,均引入T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase,T7 RNP)启动子,经鉴定正确后,先以pSC11-E转染RSV感染的可组成型表达T7多聚酶的BSR T7/5细胞进行拯救,确定微型基因组编码质粒设计的合理性,而后通过5个质粒共转染BSR T7/5细胞,并通过荧光显微镜观察荧光的表达情况判断拯救成功与否。结果:成功构建了基于T7启动子表达系统的RSV微型基因组5质粒拯救系统,并实现了拯救。结论:该系统的成功构建,有助于今后对RSV病毒开展基因修饰研究。 展开更多

关键词 呼吸道合胞病毒 微型基因组 反向遗传学

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基于T7启动子表达系统的牛副流感病毒3型微型基因组的构建与拯救

17

作者 姜男 郑妍鹏 +5 位作者 蒋桂云 张伟 焦月盈 付远辉 彭向雷 何金生 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1746-1754,共9页

【目的】通过负链RNA病毒反向遗传学操作,构建并拯救以T7启动子表达系统为基础的牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)微型基因组。【方法】分别构建表达该病毒NP、P和L蛋白的辅助质粒px8δT-PT1-b PIV3-NP、px8δ... 【目的】通过负链RNA病毒反向遗传学操作,构建并拯救以T7启动子表达系统为基础的牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)微型基因组。【方法】分别构建表达该病毒NP、P和L蛋白的辅助质粒px8δT-PT1-b PIV3-NP、px8δT-PT1-b PIV3-P和px8δT-PT1-b PIV3-L以及含增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)开放读码框(Open reading frame,ORF)、BPIV3前导序列(Leader region)、转录起始信号(Gene start signal,GS)、转录终止信号(Gene end signal,GE)和尾随序列(Trailer region)等顺式作用元件(Cis-acting elements)的微型基因组质粒p SC11-b PIV3-EGFP,鉴定正确后,采用2种不同方法拯救BPIV3微型基因组,并通过观察荧光表达情况判断是否拯救成功。【结果】成功构建了基于T7启动子表达系统的BPIV3微型基因组,并实现了拯救。【结论】该系统的成功构建,有助于今后对BPIV3开展基因修饰研究。 展开更多

关键词 牛副流感病毒3型 微型基因组 反向遗传学 拯救

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可用于辅助蛋白功能研究的人呼吸道合胞病毒双顺反子微型基因组的构建及拯救

18

作者 郑元博 张秀娟 +6 位作者 许敏 姜男 彭向雷 付远辉 郑妍鹏 洪涛 何金生 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期1004-1013,共10页

【目的】构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)双顺反子微型基因组cDNA克隆及重组质粒,并进行拯救,以探讨并验证RSV的聚合酶蛋... 【目的】构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)双顺反子微型基因组cDNA克隆及重组质粒,并进行拯救,以探讨并验证RSV的聚合酶蛋白或辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用。【方法】利用全基因合成和分子生物学相结合的方法,在获得可分别表达EGFP和无生物活性蛋白的单顺反子微型基因组质粒pUC57-RSV-EGFP和pUC57-RSV-ORF1的基础上,进一步克隆至pBR322B载体,获得编码EGFP及无生物活性蛋白的双顺反子微型基因组质粒,经限制性内切酶和核酸序列分析正确后,与可表达4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达以及RT-qPCR对EGFP mRNA的转录水平进行定量分析。【结果】成功构建了编码EGFP和无生物活性蛋白的RSV双顺反子微型基因组质粒pBR322B-RSVⅡ-EGFP,经与编码4种辅助蛋白的辅助质粒共转染至BHK-T7细胞,发现4种辅助蛋白对EGFP的表达具有不同的功能活性。【结论】以可表达EGFP报告基因的RSV双顺反子微型基因组重组质粒,实现了对4种辅助蛋白的功能验证,其中M2-1蛋白在双顺反子微型基因组拯救过程中具有转录延长的生物学活性。 展开更多

关键词 人呼吸道合胞病毒 双顺反子 微型基因组 辅助蛋白

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EGFP-LC3稳定细胞系的建立及对Aβ自噬效应的研究

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作者 房芳 张莹 +3 位作者 彭向雷 王荷 张钊 郑妍鹏 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2015年第7期984-991,共8页

该文建立了稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系,以10μmol/L的Aβ肽及其不同疏水性氨基酸含量的截短形式处理细胞24 h,计数LC3的荧光斑点数;Western blot检测LC3B表达量的变化;MTT检测特定Aβ诱导细胞自噬后对细胞活性的差异;用透射电镜确... 该文建立了稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系,以10μmol/L的Aβ肽及其不同疏水性氨基酸含量的截短形式处理细胞24 h,计数LC3的荧光斑点数;Western blot检测LC3B表达量的变化;MTT检测特定Aβ诱导细胞自噬后对细胞活性的差异;用透射电镜确认自噬体的细胞超微结构。结果显示,G418(700μg/m L)筛选6周后,建立了稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系;Aβ25-35、Aβ40和Aβ42诱导细胞内LC3荧光斑点的效果较明显;Western blot结果显示LC3B的酯化,即LC3BI向LC3BII转变;MTT检测发现,与Aβ40相比,Aβ42处理后伴随自噬的细胞毒性更强;电镜可以见到Aβ诱导的自噬小体。提示,Aβ肽及其截短的疏水性片段均可诱导自噬,且诱导自噬的效果与疏水性氨基酸含量无关;同时,Aβ42细胞损伤强于Aβ40。该研究为进一步探讨AD自噬机制提供了实验基础。 展开更多

关键词 β-淀粉样肽(Aβ) 自噬 阿尔茨海默病(AD) 微管相关蛋白轻链3(MAPLC3 LC3) 自噬小体

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人呼吸道合胞病毒感染HEp-2细胞差异表达基因的生物信息学分析

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作者 苏彦斌 刘勇 +8 位作者 王烨 王朔 薛君宇 张天笑 彭向雷 郑妍鹏 张丽姝 付远辉 何金生 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2021年第5期575-580,共6页

目的分析人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)感染HEp-2细胞后差异性表达的基因,为发现HRSV防治的潜在靶点提供线索。方法在公共基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中收集HRSV感染的HEp-2细胞表达谱数... 目的分析人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)感染HEp-2细胞后差异性表达的基因,为发现HRSV防治的潜在靶点提供线索。方法在公共基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中收集HRSV感染的HEp-2细胞表达谱数据。运用R语言分析在HRSV感染4、8、12和15 h均表现出差异表达的基因,对其进行GO分析、KEGG通路分析、蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建等。以HRSV感染HEp-2细胞4 h后,随机选择PPI中参与蛋白互作相对较高的基因在转录水平进行qRT-PCR验证。结果筛选出101个差异表达基因,其中表达上调的有92个,表达下调的有9个。功能富集分析发现HRSV感染引起HEp-2细胞中免疫应答及其信号转导等多条信号通路产生明显变化。选择的6个差异表达基因qRT-PCR验证结果与转录组数据趋势一致。结论HRSV感染HEp-2细胞引起的基因差异表达及信号通路变化,对HRSV致病分子机制及防治策略研究具有一定意义。 展开更多

关键词 人呼吸道合胞病毒 生物信息学 信号通路

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