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西藏牦牛源牛支原体对氨基糖苷类抗生素耐药靶位突变分析
1
作者 徐晋花 严明帅 +5 位作者 任才 罗婷 张冯禧 徐业芬 索朗斯珠 牛家强 《高原农业》 2023年第1期31-39,共9页
掌握西藏牦牛源牛支原体对氨基糖苷类药物的敏感性及其耐药机制,为牛支原体病的临床治疗与预防提供依据。本研究通过微量稀释法对10株牦牛源牛支原体进行了氨基糖苷类药物敏感性与耐药性试验,并对敏感株进行体外高度耐药诱导,同时分别... 掌握西藏牦牛源牛支原体对氨基糖苷类药物的敏感性及其耐药机制,为牛支原体病的临床治疗与预防提供依据。本研究通过微量稀释法对10株牦牛源牛支原体进行了氨基糖苷类药物敏感性与耐药性试验,并对敏感株进行体外高度耐药诱导,同时分别提取敏感株、临床耐药株和体外诱导高度耐药株基因组进行氨基糖苷类药物耐药基因靶位分析与药物主动外排系统研究。结果显示,敏感株和耐药株在靶位基因中未检测到相应位点的碱基突变,体外诱导高度耐药株M.bovis 3和M.bovis 7发生了A1409G基因位点突变,M.bovis 1和M.bovis 5发生了A1409G和C1192T基因位点突变,M.bovis 4和M.bovis 9发生了A1408T和C1192T基因位点突变;经药物主动外排系统检测分析,结果显示,西藏牦牛源牛支原体不存在以氨基糖苷类抗生素为底物的主动外排系统。研究结果表明,西藏牦牛源牛支原体不同分离株对氨基糖苷类药物敏感性存在较大差异,其耐药菌株的产生可能与临床长期使用单一抗生素有关。体外诱导高度耐药株对大观霉素、卡那霉素和庆大霉素产生高度耐药的原因是其耐药基因发生碱基突变,但碱基突变在牛支原体对氨基糖苷类药物耐药中是否起主导作用还有待深入研究。 展开更多
关键词 牦牛源 牛支原体 氨基糖苷类 耐药基因 基因突变
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西藏牦牛源牛支原体病本种动物模型的建立
2
作者 任才 徐晋花 +5 位作者 罗婷 李义兴 张冯禧 严明帅 索朗斯珠 牛家强 《高原农业》 2023年第6期628-637,共10页
为了在高原环境下建立牦牛源牛支原体病本种动物模型。采用鸡胚、家兔、犊牦牛对牛支原体进行菌株复壮效果验证,并将3个复壮株分别进行犊牦牛回归试验;通过临床症状观察、病理组织学观察等方法,以评价牦牛源牛支原体病动物模型效果,明... 为了在高原环境下建立牦牛源牛支原体病本种动物模型。采用鸡胚、家兔、犊牦牛对牛支原体进行菌株复壮效果验证,并将3个复壮株分别进行犊牦牛回归试验;通过临床症状观察、病理组织学观察等方法,以评价牦牛源牛支原体病动物模型效果,明确鸡胚、家兔能否作为牛支原体的复壮载体。结果显示,3个不同载体复壮株接种犊牦牛后,均出现体温升高、咳嗽、流涕、体重增长缓慢等临床症状,呈间歇性排菌,第7 d可检测到牛支原体抗体,且持续存在。剖检发现其肺组织呈现不同程度的损伤,主要以弥散性充血、出血、淤血、干酪样坏死为主要特征,病理组织学发现肺泡出现萎缩、塌陷,肺泡壁增厚,部分炎症细胞浸润等病理变化。本试验证明鸡胚、家兔均可作为牛支原体的复壮载体,且成功建立了牦牛源牛支原体病本种动物模型。 展开更多
关键词 牦牛 牛支原体 复壮载体 动物模型
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非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立 被引量：4
3
作者 张冯禧 肖琦 +7 位作者 朱家平 尹力鸿 赵霞玲 严明帅 徐晋花 温立斌 牛家强 何孔旺 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第16期3256-3266,共11页
【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,... 【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 P30蛋白 单克隆抗体 抗原表位 阻断ELISA
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西藏牦牛源牛支原体T10株全基因组测序及其序列分析
4
作者 罗婷 韩著 +4 位作者 徐业芬 蔡林 索朗斯珠 徐晋花 牛家强 《畜牧兽医学报》 CAS 2024年第5期2154-2167,共14页
旨在进一步完善牛支原体全基因组数据库,阐明其生物学功能和遗传进化关系,对西藏牦牛源牛支原体T10株进行了全基因组测序及其序列分析。使用Nanopore和Illumina PE150测序平台对T10株进行全基因组序列测定,利用生物信息学对其进行基因... 旨在进一步完善牛支原体全基因组数据库,阐明其生物学功能和遗传进化关系,对西藏牦牛源牛支原体T10株进行了全基因组测序及其序列分析。使用Nanopore和Illumina PE150测序平台对T10株进行全基因组序列测定,利用生物信息学对其进行基因组特征分析和利用基因系统进化树与国内外分离株进行遗传进化关系比对。基因测序结果显示,T10株全基因组大小为987 812 bp, GC含量为29.27%,预测到822个编码基因,编码基因总长度为709 129 bp;通过功能数据库注释结果显示,注释到与膜转运蛋白相关基因22个,碳水化合物酶相关基因7个、糖基转移酶类相关基因4个,分泌蛋白基因相关43个、T3SS效应蛋白相关基因51个,病原与宿主互作相关基因28个,细菌毒力相关基因14个,抗性相关基因10个;通过比较基因组学分析结果显示,T10与08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45均存在氨基酸突变和基因片段的插入或缺失,以及基因家族数量的差异,其中基因家族数量差异在8~32个。通过遗传进化关系分析结果显示:T10与HB0801、16M、Hubei-1、CQ-W70、NM2012、Ningxia-1、08M、JF4278、KG4397和PG45均在同一分支,但与PG1、PG2处于不同分支,其中与HB0801亲缘关系最近,与PG45亲缘关系较远。本研究不仅完善了牛支原体全基因组数据库,详细阐述了与致病性相关基因,还充分阐明了T10株以及与国内外其他牛支原体之间的遗传进化关系,明确了T10株基本基因组信息以及与国内外菌株亲缘关系,为后续进行致病机制以及疫苗研究提供理论依据。 展开更多
关键词 牦牛 牛支原体 全基因组测序 基因功能注释 比较基因组
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