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应用荧光染色剂Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide染色识别家蚕微孢子虫 被引量：6
1
作者 戴卫江 陈功 +5 位作者 彭祥然 李孝良 马琳 唐旭东 徐莉 沈中元 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期62-67,共6页
家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一法定检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)是主要的检疫方法,但其准确性受到多种因素影响。为探究应用荧光增白剂28(Fluorescent Brightener 28,FB28)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)... 家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一法定检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)是主要的检疫方法,但其准确性受到多种因素影响。为探究应用荧光增白剂28(Fluorescent Brightener 28,FB28)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色识别Nb孢子的可行性,以感染Nb的家蚕幼虫中肠、蚕卵、母蛾、蚁蚕为材料,联合应用以上2种荧光染色剂进行Nb孢子检测效果试验。在荧光显微镜下可见成熟的Nb孢子被FB28染成蓝色且细胞核被PI染成红色,而未成熟的孢子只能被PI染色。采用2种荧光染色剂染色,在被感染的幼虫中肠、蚕卵、母蛾、蚁蚕中都能够检测到Nb孢子,并且带毒母蛾研磨液样品稀释1 000倍依然可以检测到Nb孢子。幼虫中肠感染后1~2 d很难观察到Nb孢子,感染后3 d可以观察到局部存在少量未成熟的Nb,感染后4 d开始局部出现成熟的Nb,至感染后5~6 d可见组织中大面积分布有成熟孢子和未成熟孢子。荧光显微镜下观察被染色的Nb孢子的细胞核明显小于幼虫中肠细胞核,且亮度明显较强,卵壳、母蛾、蚁蚕表面的几丁质碎片形状与Nb孢子明显不同,并且不能被PI染色。试验结果表明,该染色检测方法可以排除蚕体组织细胞、几丁质碎片的干扰,提高对Nb检测的准确度,并且在Nb浓度较低的情况下,可以提高检测的灵敏度。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 检疫方法 荧光增白剂28 碘化丙啶 荧光染色
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家蚕微孢子虫海藻糖酶(Trehalase)基因的生物信息学分析及原核表达和多克隆抗体制备 被引量：3
2
作者 李孝良 彭祥然 +4 位作者 陈功 戴卫江 唐旭东 徐莉 沈中元 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1026-1034,共9页
海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码... 海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4),除了Nb Tre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区。基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了Nb Tre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 k D,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点。通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得Nb Tre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合Nb Tre1蛋白,其分子质量与预期值一致。融合Nb Tre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600。通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 海藻糖酶 序列特征 基因克隆 原核表达 多克隆抗体
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纳米金比色法在家蚕微孢子虫检测中的应用 被引量：1
3
作者 戴卫江 陈红丽 +5 位作者 张志林 尚瑞沙 齐静茹 张轶岭 唐顺明 沈中元 《江苏农业科学》 2019年第12期208-211,共4页
家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,简称Nb)是目前最主要的检疫手段,但其准确性受到多种因素影响。建立一种简便、快捷、准确的Nb检测技术,对家蚕微粒子病的防治具有重要意义。基于纳米金... 家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,简称Nb)是目前最主要的检疫手段,但其准确性受到多种因素影响。建立一种简便、快捷、准确的Nb检测技术,对家蚕微粒子病的防治具有重要意义。基于纳米金(AuNPs)比色法原理,对AuNPs探针的制备及其标记的最佳抗体浓度和最佳pH值进行探究,以及探究AuNPs比色法检测Nb的灵敏度。结果表明,Nb抗体与AuNPs(20nm)结合最佳浓度为每500μLAuNPs溶液中添加5μL0.5mg/mL抗体蛋白,标记最佳pH值为8.5。AuNPs比色法能够最低检测出Nb蛋白量为10ng。本研究成功建立一种基于AuNPs比色法检测Nb的新方法。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 多克隆抗体 纳米金 探针 比色法
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家蚕微孢子虫烯醇化酶(Enolase)基因的克隆及序列分析与原核表达 被引量：2
4
作者 彭祥然 李孝良 +6 位作者 陈功 戴卫江 李楠 王玮 唐旭东 徐莉 沈中元 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1035-1040,共6页
烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模... 烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 烯醇化酶 基因克隆 序列分析 原核表达
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家蚕微孢子虫假定层粘连蛋白基因NbHLAMB4的克隆和序列分析及互作蛋白质筛选
5
作者 李楠 戴卫江 +4 位作者 李孝良 彭祥然 唐旭东 徐莉 沈中元 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期656-661,共6页
层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的黏附等方面都有重要作用。通过检索微孢子虫数据库发现家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)存在假定层粘连蛋白基因Nb HLAMB4,根据该基因序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为... 层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的黏附等方面都有重要作用。通过检索微孢子虫数据库发现家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)存在假定层粘连蛋白基因Nb HLAMB4,根据该基因序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了Nb HLAMB4基因。该基因的开放阅读框(ORF)全长为1 104 bp,预测编码的蛋白质含有367个氨基酸,分子质量为43.74 k D,等电点为5.72。Nb HLAMB4蛋白序列含有一个N-糖基化位点和Pfam:SAS-6_N结构域,无信号肽,也无跨膜结构域。应用酵母双杂交技术,以Nb HLAMB4作为诱饵蛋白,通过筛选家蚕中肠c DNA文库,初步得到3个与Nb HLAMB4互作的候选蛋白质,分别是家蚕热休克蛋白(Hsp40)、锌指蛋白420类似物(similar to zinc finger protein 420)、氨肽酶N(aminopeptidase N)。研究结果为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制提供了新的线索。 展开更多
关键词 家蚕微孢子虫 假定层粘连蛋白 基因克隆 酵母双杂交技术 互作蛋白质
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