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靶向淋巴细胞激活基因3(LAG-3)纳米抗体的筛选与活性分析 被引量：1
1
作者 文蕊鑫 陈玥雯 +3 位作者 杨紫薇 闫凤英 李卿 武卫党 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1024-1031,共8页
目的建立淋巴细胞激活基因3(LAG-3)免疫噬菌体纳米抗体文库,获得高特异性和亲和力的抗LAG-3纳米抗体,并鉴定其功能活性。方法采用人LAG-3蛋白免疫羊驼,获取外周血cDNA;通过巢式PCR获得纳米抗体基因,构建至pComb3XSS质粒,电转至大肠杆菌X... 目的建立淋巴细胞激活基因3(LAG-3)免疫噬菌体纳米抗体文库,获得高特异性和亲和力的抗LAG-3纳米抗体,并鉴定其功能活性。方法采用人LAG-3蛋白免疫羊驼,获取外周血cDNA;通过巢式PCR获得纳米抗体基因,构建至pComb3XSS质粒,电转至大肠杆菌XL1-Blue中构建纳米抗体噬菌体免疫文库,并对文库进行质量分析。通过噬菌体展示技术筛选抗LAG-3特异性纳米抗体,通过第二代基因测序技术获得纳米抗体的基因序列。将目的序列构建到大肠杆菌BL21(DE3)周质表达载体pET-22b(+)中进行抗体表达,Prism A柱进行纯化,通过高效液相色谱-质谱分析(HPLC-MS)、ELISA、Western blot法和表面等离子共振技术(SPR)进行抗体性质和功能分析。结果构建的纳米抗体噬菌体免疫文库的库容为7.20×10^(8)菌落形成单位(CFU),序列分析文库多样性良好,经过4轮淘筛后获得3条具有不同氨基酸序列的抗LAG-3纳米抗体,分别为重链抗体重链可变区结构域-L1-3(VHH-L1-3)、VHH-L3-2和VHH-L13-2,纳米抗体表达纯化后纯度在95%以上,三种抗体均可以与重组人LAG-3蛋白进行特异性结合;其中VHH-L13-2抗体的亲和力指数KD值为3.971×10^(-9)mol/L,且对于LAG-3和纤维蛋白原样蛋白1(FGL-1)的结合具有抑制作用,半数抑制浓度(IC_(50))值为15.58 nmol/L。结论成功构建了LAG-3纳米抗体噬菌体免疫文库,筛选获得了特异性好、亲和力高的LAG-3纳米抗体,且对于LAG-3与其配体的结合具有一定的抑制作用。 展开更多
关键词 纳米抗体 淋巴细胞激活基因3(LAG-3) 噬菌体展示技术 原核表达
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基于药物转运体的元胡止痛方药效成分延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素跨血脑屏障机制研究 被引量：2
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作者 文蕊鑫 王泽 +8 位作者 陈玥雯 慈小燕 董艳 崔涛 闫凤英 伊秀林 梁士民 傅鹏 武卫党 《药物评价研究》 CAS 2023年第3期552-558,共7页
目的基于药物转运体研究元胡止痛方药效成分延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素跨血脑屏障转运机制。方法建立hCMEC/D3-U87双层细胞模型研究延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素的跨血脑屏障吸收情况... 目的基于药物转运体研究元胡止痛方药效成分延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素跨血脑屏障转运机制。方法建立hCMEC/D3-U87双层细胞模型研究延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素的跨血脑屏障吸收情况;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定hCMEC/D3细胞中相关转运体蛋白多药耐药蛋白1(MDR1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、有机阳离子转运体1(OCT1)、OCT2、OCT3、有机阴离子转运体1(OCTN1)、OCTN2、OATP1A2、OATP2B1的mRNA表达水平;使用6株过表达人转运体的细胞株(S2-OCT1、S2-OCT3、S2-OCTN1、S2-OCTN2、HEK293-OATP1A2、HEK293-OATP2B1)进行摄取实验,判断各药物成分是否为转运体蛋白的底物。结果各成分均可以一定程度地跨越血脑屏障,延胡索乙素、欧前胡素、异欧前胡素具有更好的跨血脑屏障特性,巴马汀和原阿片碱的跨血脑屏障能力较弱。外排型转运蛋白MDR1、BCRP和摄入型转运蛋白OCTN1、OATP2B1、OATP1A2在hCMECD3细胞中有相对高的mRNA表达水平。延胡索乙素是OCT1、OCTN1和OATP1A2的底物;巴马汀是OCT1、OCT3、OCTN1、OCTN2和OATP2B1的底物;原阿片碱是OCT1、OCTN1和OCTN2的底物;欧前胡素、异欧前胡素是OCT3的底物。结论延胡索乙素可能通过转运体OATP1A2、OCT1、OCTN1跨越血脑屏障进入脑组织细胞;巴马汀可能通过OATP2B1、OCT1、OCT3、OCTN1、OCTN2传递进入脑组织细胞;原阿片碱可能通过OCT1、OCTN1和OCTN2传递进入脑组织细胞;欧前胡素、异欧前胡素可能通过OCT3传递进入脑组织细胞。 展开更多
关键词 元胡止痛方 血脑屏障 药物转运体 胡索乙素 巴马汀 原阿片碱 欧前胡素 异欧前胡素
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地西他滨通过去甲基化调节肝癌细胞对索拉非尼的耐药性
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作者 张苗 王泽 +6 位作者 傅恒涛 文蕊鑫 韩巧巧 崔涛 伊秀林 闫凤英 刘昌孝 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第16期1660-1667,共8页
目的:从表观遗传学角度探讨索拉非尼(sorafenib,Sora)治疗肝细胞癌发生耐药的机制,考察表观遗传药物地西他滨(decitabine,DAC)对索拉非尼肝细胞癌敏感性的影响,为肝癌的临床治疗提供新的思路与方法。方法:利用GEPIA 2数据库检索508例原... 目的:从表观遗传学角度探讨索拉非尼(sorafenib,Sora)治疗肝细胞癌发生耐药的机制,考察表观遗传药物地西他滨(decitabine,DAC)对索拉非尼肝细胞癌敏感性的影响,为肝癌的临床治疗提供新的思路与方法。方法:利用GEPIA 2数据库检索508例原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者信息,通过Kaplan-Meier法分析有机阴离子转运多肽1B3(organic anion transporting polypeptide 1B3,OATP1B3)表达与患者生存时间的相关性;采用亚硫酸氢盐甲基化法检测基因溶质载体有机阴离子转运体1B3(solute carrier organic anion transporter 1B3,SLCO1B3)启动子的甲基化率;采用RT-qPCR,Western Blot检测DAC作用前后肝癌细胞株OATP1B3的表达变化;采用RTCA-eSight检测索拉非尼与DAC联用对肝癌细胞增殖的影响;采用LC-MS/MS检测索拉非尼与DAC联用后肝癌细胞对索拉非尼摄入量的变化。结果:GEPIA 2数据库分析结果显示,OATP1B3高表达的HCC患者总体生存率均显著高于低表达者;亚硫酸氢盐甲基化测序结果显示Hep3B,HepG2中SLCO1B3的启动子甲基化率较高;RT-qPCR,Western Blot结果表明,肝癌细胞株Hep3B,HepG2中OATP1B3的mRNA及蛋白表达相对较低,且DAC孵育后OATP1B3的表达均上调;RTCA-eSight实验结果显示,联用DAC后Hep3B,HepG2的增殖率显著低于索拉非尼组;LC-MS/MS结果显示,HEK293-OATP1B3对索拉非尼的摄入量是HEK293-Wild的2.10倍。联用DAC后,Hep3B,HepG2对索拉非尼的摄入量提高1.87和2.47倍。结论:DAC通过抑制SLCO1B3 DNA甲基化,上调OATP1B3的表达,提高转运索拉非尼的能力,增加索拉非尼在肝癌细胞中的蓄积,增强对肝癌细胞的敏感性,从而逆转索拉非尼的耐药。 展开更多
关键词 DNA甲基化 地西他滨 索拉非尼 有机阴离子转运多肽1B3 肝细胞癌
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