三种蛋白诊断结核分枝杆菌感染的价值研究

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作者 张慕丽 孙照刚 +1 位作者 曹廷明 谢忠尧 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期808-814,共7页

目的:探讨Krüppel样转录因子2(krüppel-like transcription factor 2,KLF2)、鸟苷酸结合蛋白5(guanylate-binding protein 5,GBP5)、双特异性磷酸酶3(dual specificity phosphatase 3,DUSP3)等3种蛋白及其不同组合对于结核分... 目的:探讨Krüppel样转录因子2(krüppel-like transcription factor 2,KLF2)、鸟苷酸结合蛋白5(guanylate-binding protein 5,GBP5)、双特异性磷酸酶3(dual specificity phosphatase 3,DUSP3)等3种蛋白及其不同组合对于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的诊断价值。方法:选取2023年1—3月首都医科大学附属北京胸科医院就诊患者和同期进行健康体检的人群作为研究对象,根据结核病诊断标准将研究对象分为活动性结核病(ATB)组(145例)、结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)组(145例)、健康对照(HC)组(200名)。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测研究对象血清中KLF2、GBP5、DUSP3蛋白水平[450 nm波长吸光度值;中位数(四分位数)],采用受试者工作特征曲线分析各蛋白单独或联合诊断MTB感染的价值。结果:KLF2在HC组的蛋白水平为0.317(0.198,0.496),明显高于ATB组的0.234(0.160,0.297)及LTBI组的0.224(0.145,0.320),差异均有统计学意义(P<0.001)。GBP5在ATB组的蛋白水平为0.327(0.259,0.402),明显高于LTBI组的0.196(0.150,0.273)及HC组的0.180(0.125,0.281),差异均有统计学意义(P<0.001)。DUSP3在ATB组的蛋白水平为0.329(0.223,0.458),明显高于LTBI组的0.213(0.160,0.248)及HC组的0.196(0.132,0.297),差异均有统计学意义(P<0.001)。GBP5与DUSP3双蛋白组合区分ATB和LTBI的诊断效能[曲线下面积(AUC)为0.800]优于KLF2(AUC为0.534)、GBP5(AUC为0.761)、DUSP3(AUC为0.720)等单一蛋白及其不同组合的诊断效能,最大约登指数下的敏感度为73.79%,特异度为75.86%;GBP5、DUSP3双蛋白组合区分ATB和HC的诊断效能(AUC为0.781)优于KLF2(AUC为0.629)、GBP5(AUC为0.740)、DUSP3(AUC为0.716)等单一蛋白及其不同组合的诊断效能,最大约登指数下的敏感度为77.93%,特异度为71.50%;三种蛋白及其不同组合区分LTBI与HC的诊断效能较差,其AUC均小于0.700。结论:研发基于蛋白水平的MTB感染免疫检测方法存在可能性,蛋白联和应用可提高诊断效能。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 感染 免疫测定 诊断 鉴别

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结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定 被引量：2

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作者 曹廷明 贾红彦 +9 位作者 古淑香 郑晓静 李自慧 杜凤娇 刘洋 刘忠泉 邢爱英 杜博平 马玙 张宗德 《中国防痨杂志》 CAS 2010年第10期627-632,共6页

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿... 目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 细菌蛋白质类 抗原 细菌 重组融合蛋白质类

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结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达 被引量：2

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作者 曹廷明 贾红彦 +4 位作者 杜凤娇 刘洋 刘忠泉 马玙 张宗德 《临床肺科杂志》 2011年第12期1887-1890,共4页

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a(+):Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE... 目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a(+):Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a(+):Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 Rv1512 特异性 重组蛋白质

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分析技术在铁蛋白结构与功能研究中的应用 被引量：1

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作者 曹廷明 黄河清 孔波 《分析仪器》 CAS 2003年第2期38-41,共4页

介绍了电子光谱、电化学、电子显微镜和生物质谱等分析技术在铁蛋白亚基结构、电子隧道、电极活性和释放铁动力学研究中的应用。

关键词 铁蛋白 结构 功能 分析技术 电子光谱 电化学 电子显微镜 生物质谱 电子隧道

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结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

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作者 曹廷明 贾红彦 +9 位作者 古淑香 郑晓静 李自慧 杜凤娇 刘洋 刘忠泉 邢爱英 杜博平 马玛 张宗德 《结核病与胸部肿瘤》 2011年第1期14-18,共5页

目的构建含结核分枝杆菌（M．tb）rv2352c基因原核表达载体，经转化E．coli以表达Rv2352c融合蛋白，并研究其抗原性。方法用PCR扩增M．tbrv2352c基因，克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv2352c重组质粒，阳性克隆测序验证正... 目的构建含结核分枝杆菌（M．tb）rv2352c基因原核表达载体，经转化E．coli以表达Rv2352c融合蛋白，并研究其抗原性。方法用PCR扩增M．tbrv2352c基因，克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv2352c重组质粒，阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白，通过SDS—PAGE和结核患者血清Westernblot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔，制备抗Rv2352c抗血清，抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法（ELISA），取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Westernblot方法，检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确，SDS．PAGE和Westernblot结果显示，在45kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Westernblot鉴定证实为目的蛋白，有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a（＋）：rv2352c，制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能，为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 细菌蛋白质类 抗原 细菌 重组融合蛋白质类

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MALDI-TOF质谱技术研究铁蛋白蛋白壳表层的电荷分布 被引量：11

6

作者 黄河清 孔波 +2 位作者 林庆梅 陈晋安 曹廷明 《生物物理学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期99-103,共5页

采用SephacrylS -300排阻层析和DEAE -纤维素层析技术分离纯化鱼工鱼肝铁蛋白 (LiverferritinofDasyatisAkajei,DALF)。纯化后的DALF经梯度聚丙烯酰胺凝胶再次分离后 ,显示出两条凝胶带 ,即单分子DALF和双聚态DALF。选用基质辅助激光解... 采用SephacrylS -300排阻层析和DEAE -纤维素层析技术分离纯化鱼工鱼肝铁蛋白 (LiverferritinofDasyatisAkajei,DALF)。纯化后的DALF经梯度聚丙烯酰胺凝胶再次分离后 ,显示出两条凝胶带 ,即单分子DALF和双聚态DALF。选用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱技术 (MALDI -TOFMS)研究DALF的电荷分布时 ,发现DALF蛋白壳表层上显示出三种不同质荷比的分子离子峰 ,其质荷比为10369.41m/z、20710.33m/z和41809.43m/z。当DALF亚基被解离后 ,这三个分子离子峰随之消失 ,因而推测DALF蛋白壳表层存在着高密度正电荷区域 ,并与该蛋白形成非电惰性有着密切联系。通过拟出DALF蛋白壳表面电荷分布模型 。 展开更多

关键词 MALDI-TOF质谱 蛋白壳表层 Hong鱼肝 铁蛋白 质谱 电泳 电荷分布 电子传递

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鲨鱼和魟鱼肝铁蛋白电泳纯的制备技术 被引量：6

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作者 陈旭 黄河清 +2 位作者 孔波 曹廷明 肖志群 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期15-19,共5页

采用硫酸铵分级盐析、DEAE阴离子交换层析、SephacrylS-300凝胶层析技术分离纯化鲨鱼肝铁蛋白 (LiverferritinofSphymazygaena,SZLF)和鱼肝铁蛋白 (LiverferritinofDasyatisakajei,DALF)。电子显微镜技术揭示了SZLF和DALF的分子结构 ... 采用硫酸铵分级盐析、DEAE阴离子交换层析、SephacrylS-300凝胶层析技术分离纯化鲨鱼肝铁蛋白 (LiverferritinofSphymazygaena,SZLF)和鱼肝铁蛋白 (LiverferritinofDasyatisakajei,DALF)。电子显微镜技术揭示了SZLF和DALF的分子结构 ,阐明了两者蛋白均由蛋白壳和铁核组成。柱层析和电泳技术拓展了电泳纯的SZLF和DALF制备方法 。 展开更多

关键词 铁蛋白 电泳分离 层析分离 高纯度 鲨鱼 鱼工鱼

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实时荧光定量PCR检测不同结核标本及其联合玻璃珠磨菌法检测价值的初步研究 被引量：9

8

作者 戴广明 王芬 +3 位作者 曹廷明 褚洪迁 黄海荣 孙照刚 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2022年第5期450-454,共5页

目的:探索实时荧光定量PCR(qRT-PCR)联合玻璃珠磨菌法对检测不同临床标本中结核分枝杆菌菌载量的优化作用。方法:回顾性搜集2008年1月1日至2016年12月31日首都医科大学附属北京胸科医院住院和门诊诊治的疑似结核病患者11570份不同临床... 目的:探索实时荧光定量PCR(qRT-PCR)联合玻璃珠磨菌法对检测不同临床标本中结核分枝杆菌菌载量的优化作用。方法:回顾性搜集2008年1月1日至2016年12月31日首都医科大学附属北京胸科医院住院和门诊诊治的疑似结核病患者11570份不同临床标本的qRT-PCR检测结果并进行分析,主要包括痰液1487份、脓液273份、脑脊液1391份、气管(支气管)肺泡灌洗液41份和血液4650份等。再通过建立伪随机函数的方法从中选取82份临床诊断为肺结核的痰液标本,对其进行玻璃珠(直径0.3 mm)振荡磨菌前后qRT-PCR定量检测效果分析。结果:11570份不同临床标本的总检测阳性率为12.16%(1407/11570)。其中,气管(支气管)灌洗液的检出率最高[36.59%(15/41)],以门诊患者来源的阳性率最高[43.48%(10/23)];其次是脓液标本[35.53%(97/273)],以住院患者来源的阳性率最高[36.26%(95/262)];痰液标本位居第三[30.33%(451/1487)];其他标本阳性率介于10.43%(485/4650)~15.03%(209/1391)之间。对选取的82份痰标本行5 min的玻璃珠磨菌处理后,qRT-PCR检测的核酸浓度[44.45(9.05,71.62)×10^(7)拷贝/ml]较处理前[4.03(1.87,5.92)×10^(7)拷贝/ml]明显提高,差异有统计学意义(Z=2.120,P=0.016)。其中,有28份(34.15%)痰标本提高了菌株数量级,尤其是21份含菌量为10^(2)拷贝/ml的临床痰标本经振荡研磨后有14份(66.67%)提升到了10^(3)拷贝/ml菌量数量级,使阳性检出率由磨菌处理前的60.98%(50/82)提高到磨菌处理后的78.05%(64/82)。结论:qRT-PCR对灌洗液、脓液和痰液标本中结核分枝杆菌的检出率高,在其他标本中检出率低。采用玻璃珠振荡磨菌处理后可提高临床标本的阳性检出率。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 分子诊断技术 实验室技术和方法 评价研究

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MALDI-TOF质谱、电泳和透射电子显微镜技术研究魟鱼肝铁蛋白H和L亚基特性 被引量：3

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作者 黄河清 胡晓慧 +2 位作者 方雪萍 曹廷明 孔波 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2009年第5期631-636,共6页

小批量制备质谱纯魟鱼肝铁蛋白(liver ferritin of Dasyatis akajei,DALF),以透射电子显微镜术(TEM)测定DALF、蛋白壳和铁核的分子尺寸。SDS-PAGE技术指出,DALF由H和L两种不同类型的亚基组成。采用肽质量指纹图谱(PMF)技术进一步佐证H和... 小批量制备质谱纯魟鱼肝铁蛋白(liver ferritin of Dasyatis akajei,DALF),以透射电子显微镜术(TEM)测定DALF、蛋白壳和铁核的分子尺寸。SDS-PAGE技术指出,DALF由H和L两种不同类型的亚基组成。采用肽质量指纹图谱(PMF)技术进一步佐证H和L亚基类型和同源性。氧化还原剂中性红、劳氏紫、甲基紫精和pH1.5酸度均无法削弱DALF的H-L和L-L亚基之间的相互作用强度、并解吸出L亚基离子,供MALDI-TOF质谱仪分析。通过增加激光强度和降低基质pH途径,可直接分析DALF的H和L亚基的分子量,指出DALF中H-L和L-L亚基之间的相互作用强度明显高于H-H亚基类型。 展开更多

关键词 铁蛋白 亚基类型 电镜 质谱 电泳

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结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药相关基因的筛选及鉴定 被引量：6

10

作者 郑晓静 杜博平 +9 位作者 贾红彦 侯继增 杨超 高汉青 杜凤娇 邢爱英 李自慧 曹廷明 张宗德 李琦 《北京医学》 CAS 2012年第9期783-786,共4页

目的筛选二线抗结核药物对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)的耐药相关基因。方法构建H37Rv转座子文库,筛选PAS耐药克隆,随机引物PCR扩增转座子插入突变基因。在PAS耐药菌株中鉴定耐药相关基因的突变情况。结果构建了较完整的H... 目的筛选二线抗结核药物对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)的耐药相关基因。方法构建H37Rv转座子文库,筛选PAS耐药克隆,随机引物PCR扩增转座子插入突变基因。在PAS耐药菌株中鉴定耐药相关基因的突变情况。结果构建了较完整的H37Rv转座子文库,并筛选出201个PAS耐药克隆,经测序找到4个可能的PAS耐药相关基因,分别是Rv1534、pknF、ndh、papA1。papA1基因检测到一个无义突变,为papA1基因339位C→T点突变。结论酰基转移酶基因papA1可能为PAS耐药相关基因。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 耐药 对氨基水杨酸 基因

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复苏因子E-DNA疫苗对BALB/C小鼠免疫效应的研究 被引量：4

11

作者 邢爱英 刘忠泉 +7 位作者 贾红彦 李自慧 郑晓静 曹廷明 杜风娇 杜博平 古淑香 张宗德 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2010年第23期4259-4261,共3页

目的:探索复苏因子E(RpfE)-DNA疫苗的小鼠免疫效果。方法:利用真核表达载体PCDNA3.1构建PCDNA3.1-RpfE重组质粒。将SPF级BALB/C小鼠随机分为5组,即空质粒组、RpfE质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组,于0、3、6周先后3次免疫小鼠,在... 目的:探索复苏因子E(RpfE)-DNA疫苗的小鼠免疫效果。方法:利用真核表达载体PCDNA3.1构建PCDNA3.1-RpfE重组质粒。将SPF级BALB/C小鼠随机分为5组,即空质粒组、RpfE质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组,于0、3、6周先后3次免疫小鼠,在第3次免疫后3周,心脏取血ELISA方法检测血清RpfE IgG抗体效价、干扰素γ(IFNγ)水平;并行脾淋巴细胞培养,以RpfE蛋白刺激淋巴细胞,CCK-8法检测淋巴细胞增殖指数、ELISA方法检测上清诱导IFNγ和白介素12(IL-12)产生水平,乳酸脱氢酶试验检测小鼠脾细胞毒性T淋巴(CTL)杀伤效应。结果:(1)RpfE质粒组小鼠血清中RpfE抗体水平明显高于其他各组(P<0.001);RpfE质粒组IFNγ水平明显高于空质粒组、生理盐水组、空白对照组和BCG组(P<0.01或P<0.05)。(2)RpfE质粒组具有较强的刺激淋巴细胞增殖作用,CCK-8实验表明其增殖指数高于其他各组(P<0.05);上清ELISA检测表明IFNγ和IL-12产生水平也高于其他各组(P<0.05)。(3)RpfE质粒组脾淋巴细胞特异性CTL杀伤性与其他各组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:RpfE-DNA疫苗可诱导小鼠的免疫应答,具有良好的体液和细胞免疫原性。 展开更多

关键词 疫苗 DNA RpfE 免疫

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不同抗原酶联免疫斑点检测技术对结核性胸膜炎辅助诊断价值的比较 被引量：6

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作者 杜凤娇 陈曦 +9 位作者 刘菲 刘洋 曹廷明 刘忠泉 贾红彦 邢爱英 杜博平 古淑香 马玙 张宗德 《北京医学》 CAS 2011年第12期981-985,共5页

目的探讨结核分枝杆菌不同抗原的酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)对结核性胸膜炎的辅助诊断价值。方法分离55例结核性胸膜炎患者和43例恶性胸腔积液患者的胸腔积液单个核细胞(PEMCs),经早期分泌抗原靶6kD(ESAT-6)、培养滤液蛋白10kD(CFP-... 目的探讨结核分枝杆菌不同抗原的酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)对结核性胸膜炎的辅助诊断价值。方法分离55例结核性胸膜炎患者和43例恶性胸腔积液患者的胸腔积液单个核细胞(PEMCs),经早期分泌抗原靶6kD(ESAT-6)、培养滤液蛋白10kD(CFP-10)、ESAT-6/CFP-10融合蛋白(E/C)、Rv3873和Rv3879c5个蛋白抗原共同孵育,进行ELISPOT试验,检测经抗原刺激后分泌干扰素-γ(IFN-γ)的效应T淋巴细胞(即斑点形成细胞,SFC)的数量,以中位数(四分位间距)表示。结果结核性胸膜炎组ESAT-6-ELISPOT、E/C-ELISPOT、CFP-10-ELISPOT、Rv3873-ELISPOT和Rv3879c-ELISPOT每孔的SFC数量分别为27(13～65)/5×104,26(12～52)/5×104,34(18～79)/5×104,26(8～50)/5×104和11(1～24)/5×104,均显著高于恶性胸膜积液组[1(0～2)/5×104,2(0～4)/5×104,2(1～4)/5×104,3(1～6)/5×104和1(0～3)/5×104,P均<0.01]。5个抗原中E/C的敏感性最高(92.7%),ESAT-6和Rv3879c的特异性最高(均为93.0%),ESAT-6的诊断准确性最高(91.8%)。结论 ESAT-6联合新抗原Rv3879c的ELISPOT能够辅助诊断结核性胸膜炎,但其特异性易受结核分枝杆菌潜伏感染的影响。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 酶联免疫斑点检测技术 胸腔积液

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结核分枝杆菌复苏因子对结核性胸腔积液中结核分枝杆菌生长促进作用的探索 被引量：2

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作者 邢爱英 刘忠泉 +9 位作者 杜博平 孙琦 贾红彦 魏荣荣 刘洋 曹廷明 杜凤娇 古淑香 马玙 张宗德 《中国防痨杂志》 CAS 2014年第5期369-374,共6页

目的探讨结核分枝杆菌复苏因子（resuscitationpromotingfactor，Rpf）对结核性胸腔积液中病原菌生长的促进作用，以期提高临床标本体外培养阳性率，缩短培养时间。方法选择2012年10月至2013年10月期间北京胸科医院62例结核性胸膜炎患... 目的探讨结核分枝杆菌复苏因子（resuscitationpromotingfactor，Rpf）对结核性胸腔积液中病原菌生长的促进作用，以期提高临床标本体外培养阳性率，缩短培养时间。方法选择2012年10月至2013年10月期间北京胸科医院62例结核性胸膜炎患者，抽取胸腔积液经过离心处理后分别接种于改良罗氏培养基，以及含高、低浓度Rpf的MiddleBrook7H11固体培养基（简称“7H11培养基”）和生理盐水7H11培养基（生理盐水阴性对照组）中，每隔3d观察菌落形成情况，阳性者行抗酸染色（AFB）、PCR扩增试验及DNA测序进行菌种鉴定，观察比较高、低浓度Rpf对Mtb的促进生长作用。利用统计软件SPSS17．0进行统计学分析。Rpf培养组与改良罗氏培养组，以及Rpf培养组与生理盐水阴性对照组Mtb培养阳性率比较采用配对计数资料的x2检验；不同浓度Rpf培养组与生理盐水阴性对照组可视菌落平均时间（d）和阳性菌落数量比较采用配对样本t检验。以P〈0．05为差异有统计学意义。结果（1）结核性胸腔积液改良罗氏培养组中的Mtb培养阳性率为16．1％（10／62），含Rpf的7H11培养基中的Mtb培养阳性率为43．5％（27／62），两者比较差异具有统计学意义（x2=12．84，P〈0．01）；（2）含高、低浓度Rpf7H11培养基的可视菌落形成时间各为（20．92±0．58）d和（21．69±0．50）d，两组间差异无统计学意义（t=0．085，P〉0．05），但显著快于生理盐水对照组（不含Rpf）的（38．08±0．94）d（t值分别为10．19、9．91，P值均GO．001）；（3）含高、低浓度Rpf的7H11培养基菌落形成单位数各为（34．12±4．06）×10^2和（37．27±5．63）×10^2，两组间差异无统计学意义（t=0．45，P〉0．05），但显著多于生理盐水对照组（3．77±0．88）×10^2（t值分别为5．88、7．30，P值均〈0．001）。结论接种结核性胸腔积液后，含Rpf的7H11培养基较改良罗氏培养基可提高Mtb的培养阳性率，并缩短培养时间。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 复苏因子 培养 比较研究

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结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

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作者 邢爱英 刘忠泉 +8 位作者 刘洋 贾红彦 李自慧 郑晓静 曹廷明 杜凤娇 杜博平 古淑香 张宗德 《中国防痨杂志》 CAS 2012年第8期532-537,共6页

目的评价Mtb复苏因子DNA疫苗(resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA)对Mtb感染宿主的免疫保护作用。方法构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c小鼠(4周龄)分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-... 目的评价Mtb复苏因子DNA疫苗(resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA)对Mtb感染宿主的免疫保护作用。方法构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c小鼠(4周龄)分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染。检测血清复苏因子(Rpf)抗体、IFN-γ;RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验;检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2;对肺组织进行病理学检测和细菌负荷(CFU)计数。结果 (1)疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平:Rpf D组0.32±0.1,Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01,空质粒组0.01±0.0,生理盐水组0.09±0.04,空白对照组0.03±0.01,RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:45.6,43.2,45.1,45.7;Rpf E:51.6,53.6,51.0,52.2;P值均<0.01。血清IFN-γ:Rpf D组(43.9±24.8)pg/ml,Rpf E组(45.9±21.0)pg/ml,BCG组(21.0±11.0)pg/ml,空质粒组(7.9±4.9)pg/ml,生理盐水组(4.7±2.1)pg/ml,空白对照组(5.8±4.7)pg/ml,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组比较差异有统计学意义(F值分别为Rpf D:10.2;Rpf E:12.4;P值均<0.05),与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:15.6,17.8,17.3;Rpf E:17.5,21.1,20.7;P值均<0.01。(2)淋巴细胞增殖实验CCK-8:Rpf D组176.0±4.2,Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1,空质粒组100.0±6.8,生理盐水组104.0±8.4,空白对照组116.0±2.2,RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:9.5,10.1,10.0,9.0;Rpf E:11.2,12.9,11.7,10.3;P值均<0.05。细胞杀伤实验:Rpf D组32.0±3.2,Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9,空质粒组3.3±1.5,生理盐水组6.7±0.5,空白对照组7.3±3.5,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:8.8,14.5,13.7,11.9;Rpf E:8.1,12.5,11.6,11.1;P值均<0.05。(3)Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测:IL-2:Rpf D组9.5±2.4,RpfE组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1,空质粒组1.2±0.3,生理盐水组1.8±1.0,空白对照组1.5±0.7,Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:12.5,14.6,13.5,13.9;Rpf E:12.0,13.6,13.1,13.2;P值均<0.05。IFN-γ:Rpf D组22.2±5.7,Rpf E组28.7±14.4,BCG组16.1±10.1,空质粒组9.8±1.6,生理盐水组13.2±2.1,空白对照组15.7±2.9,RpfD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:7.8,12.6,8.7,8.3;Rpf E:11.3,16.4,14.7,14.2;P值均<0.05。结论实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫,有希望成为结核病候选疫苗之一。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 细菌蛋白质类 细胞因子类 疫苗 DNA

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结核分枝杆菌Rv0808基因的克隆、表达、纯化及抗原性研究

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作者 李自慧 杜博平 +8 位作者 贾红彦 古淑香 邢爱英 周立娟 曹廷明 郑晓静 刘忠泉 杜凤娇 张宗德 《北京医学》 CAS 2012年第9期792-795,F0002,共5页

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)体内诱导基因Rv0808,并制备多克隆抗体,研究其编码蛋白的抗原性,了解诊断应用价值。方法高保真PCR扩增Rv0808基因,克隆入表达载体pET-30a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)... 目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)体内诱导基因Rv0808,并制备多克隆抗体,研究其编码蛋白的抗原性,了解诊断应用价值。方法高保真PCR扩增Rv0808基因,克隆入表达载体pET-30a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3),测序正确的克隆用IPTG诱导表达。用镍柱纯化重组蛋白,然后用纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备和纯化多克隆抗体。将重组蛋白分别与多克隆抗体和结核病患者血清进行Western blot鉴定,并尝试用多克隆抗体进行免疫组化染色检测巨噬细胞中M.tb。结果成功构建了pET-30a(+):Rv0808重组表达载体。经过重组蛋白的可溶性表达及纯化后,SDS-PAGE结果显示在66kD处有一单一蛋白条带。将此蛋白免疫新西兰白兔后获得了效价为6400的多克隆抗体。重组蛋白与多克隆抗体可以发生免疫反应,但却不能检测出结核患者血清中的相应抗体。用此多克隆抗体也无法检测出巨噬细胞中的M.tb。结论结核分枝杆菌Rv0808编码蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,但可能对于结核病的诊断价值较小。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 抗原 诊断

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结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

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作者 邢爱英 刘忠泉 +8 位作者 刘洋 贾红彦 李自慧 郑晓静 曹廷明 杜凤娇 杜博平 古淑香 张宗德 《结核病与胸部肿瘤》 2012年第3期166-171,共6页

目的评价Mtb复苏因子DNA疫苗（resuscitation-promoting factor DNA, Rpf-DNA）对Mtb感染宿主的免疫保护作用。方法构建复苏因子D（Rpf D—DNA）和复苏因子E（Rpf E-DNA）质粒疫苗，180只BALB／c小鼠（4周龄）分为6组，每组30只，分别... 目的评价Mtb复苏因子DNA疫苗（resuscitation-promoting factor DNA, Rpf-DNA）对Mtb感染宿主的免疫保护作用。方法构建复苏因子D（Rpf D—DNA）和复苏因子E（Rpf E-DNA）质粒疫苗，180只BALB／c小鼠（4周龄）分为6组，每组30只，分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫，H37Rv标准株气溶胶感染。检测血清复苏因子（Rpf）抗体、IFN—γ；Rpf D、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验；检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2；对肺组织进行病理学检测和细菌负荷（CFU）计数。结果（1）疫苗免疫组血清RpfD、RpfE抗体水平：RpfD组0．32±0．1，RpfE组0．39±0．1，BCG组0．02±0．01，空质粒组0．01±0．0，生理盐水组0．09±0．04，空白对照组0．03±0．01，RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义，F值分别为RpfD：45．6，43．2，45．1，45．7；RpfE：51．6，53．6，51．0，52．2：P值均〈0．01。血清IFN-γ：RpfD组（43．9±24．8）pg／ml，RpfE组（45．9±21．0）pg／ml，BCG组（21．0±11．0）pg／ml，空质粒组（7．9±4．9）pg／ml，生理盐水组（4．7±2．1）pg／ml，空白对照组（5．8±4．7）pg/ml，RpfD、RpfE质粒组与BCG组比较差异有统计学意义（F值分别为RDfD：10．2；RpfE：12.4；P值均〈0．05），与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义，F值分别为RpfD：15．6，17．8，17．3；RpfE：17．5，21．1，20．7P值均（0．01。（2）淋巴细胞增殖实验CCK-8：RpfD组176．0±4．2，RpfE组183．0±4．3，BCG组101．0±1．1，空质粒组100．0±6．8，生理盐水组104．0±8．4，空白对照组116．0±2．2，RDfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：9．5，10．1，10．0，9．0；RpfE：11．2，12．9，11．7，10．3；P值均〈0．05。细胞杀伤实验：RpfD组32．0±3．2，RpfE组30．0±4．2，BCG组16．0±5．9，空质粒组3．3±1．5，生理盐水组6．7±0．5，空白对照组7．3±3．5，RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：8．8，14．5，13．7，11．9；RpfE：8．1，12．5，11．6，11．1；P值均〈0．05。（3）RpfD、RpfE蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测：IL-2：RpfD组9．5±2．4，RpfE组9．2±1．2，BCG组2．4±2．1，空质粒组1．2±0.3，生理盐水组1．8±1．0，空白对照组1．5±0．7，RpfD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：12．5，14．6，13．5，13．9；RpfE：12．0，13．6，13．1，13．2：P值均〈0．05。IFN—γ：RpfD组22．2±5．7，RpfE组28．7±14．4，BCG组16．1±10．1，空质粒组9.8±1．6，生理盐水组13．2±2．1，空白对照组15．7±2．9，RpfD、RDfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：7．8，12．6，8．7，8．3；RpfE：11．3，16．4，14．7，14．2；P值均〈0．05。结论实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫，有希望成为结核病候选疫苗之一。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 细菌蛋白质类 细胞因子类 疫苗 DNA

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不同抗原酶联免疫斑点检测技术对结核性胸膜炎辅助诊断价值的比较

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作者 杜凤娇 陈曦 +9 位作者 刘菲 刘洋 曹廷明 刘忠泉 贾红彦 邢爱英 杜博平 古淑香 马玙 张宗德 《结核病与胸部肿瘤》 2011年第2期99-102,共4页

目的探索结核分枝杆菌不同抗原的酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT），对结核性胸膜炎的辅助诊断价值。方法分离55例结核性胸膜炎患者和43例恶性胸腔积液患者的胸腔积液单个核细胞，经5个蛋白抗原：ESAT-6、CFP-10、ESAT-6／CFP-10融合蛋... 目的探索结核分枝杆菌不同抗原的酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT），对结核性胸膜炎的辅助诊断价值。方法分离55例结核性胸膜炎患者和43例恶性胸腔积液患者的胸腔积液单个核细胞，经5个蛋白抗原：ESAT-6、CFP-10、ESAT-6／CFP-10融合蛋白（E／C）、Rv3873和Rv3879c共同孵育，进行ELISPOT试验，检测经抗原刺激后分泌IFN—γ的效应T淋巴细胞（即斑点形成细胞，SFC）的数量，用中位数（四分位间距）表示。结果结核性胸膜炎组ESAT-6-ELISPOT、E／C—ELISPOT、CFP-10-ELISPOT、Rv3873-ELISPOT和Rv3879c—ELISPOT每孔的SFC分别为27（13-65），26（12-52），34（18-79），26（8～50）和11（1～24），均显著高于恶性胸腔积液组的1（0～2），2（0～4），2（1～4），3（1～6）和1（0～3），均有P〈0.01。5个抗原中E／C的敏感度最高92．7％，ESAT．6和Rv3879c的特异度最高93．O％，ESAT-6的诊断准确性最高。结论ESAT-6联合新抗原Rv3879c的ELISPOT能够辅助诊断结核性胸膜炎，但其特异度易受MTB潜伏感染的影响。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 酶联免疫斑点检测技术 胸腔积液 诊断

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结核分枝杆菌对氨基水杨酸耐药相关基因的筛选及鉴定

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作者 郑晓静 杜博平 +9 位作者 贾红彦 侯继增 杨超 高汉青 杜凤娇 邢爱英 李自慧 曹廷明 张宗德 李琦 《结核病与胸部肿瘤》 2012年第3期162-165,共4页

目的筛选二线抗结核药物对氨基水杨酸（para-aminosalicylic acid，PAS）耐药相关基因。方法构建H37Rv转座子文库，筛选对氨基水杨酸耐药克隆，随机引物PCR扩增转座子插入突变基因。在PAS耐药菌株中鉴定耐药相关基因的突变情况。结果构... 目的筛选二线抗结核药物对氨基水杨酸（para-aminosalicylic acid，PAS）耐药相关基因。方法构建H37Rv转座子文库，筛选对氨基水杨酸耐药克隆，随机引物PCR扩增转座子插入突变基因。在PAS耐药菌株中鉴定耐药相关基因的突变情况。结果构建了较完整的H37Rv转座子文库，并筛选出201个PAS耐药克隆，经测序找到4个可能的PAS耐药相关基因。papA1基因检测到一个无义突变。结论酰基转移酶基因papA1可能为PAS耐药相关基因。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 耐药 对氨基水杨酸 基因

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11种结核分枝杆菌抗原皮肤试验反应效果评价 被引量：2

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作者 段惠娟 褚洪迁 +3 位作者 孔成成 戴广明 曹廷明 孙照刚 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2021年第3期255-260,共6页

目的评估11种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原用于MTB致敏后豚鼠皮肤试验反应的效果。方法选取18只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级豚鼠(雌性,体质量250~300g),按接种剂量分为高(5μg)、中(0.5μg)、低(... 目的评估11种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原用于MTB致敏后豚鼠皮肤试验反应的效果。方法选取18只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级豚鼠(雌性,体质量250~300g),按接种剂量分为高(5μg)、中(0.5μg)、低(0.1μg)3组,每组6只。采用MTB标准株(H37Rv,ATCC27294)致敏豚鼠,致敏成功后豚鼠背部去毛皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)、重组结核杆菌融合蛋白(EC)和11种MTB抗原(包括重组抗原Rv3872、MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3117、Rv3120、Rv2346c、Rv3619c、Rv3425、Rv1738和Rv2626c),各0.1ml。分别于注射24h和48h后观察皮肤试验反应,测量硬结平均直径[(横径+纵径)/2],以硬结平均直径≥5mm为阳性。分析11种MTB抗原皮肤试验反应与TB-PPD和EC的差异。结果抗原注射24h后,剂量为5μg时Rv3120、Rv3619c的皮肤试验反应阳性率分别为9/9和8/9;剂量为0.5μg时EC、MPT64的皮肤试验反应均为阳性。TB-PPD(5IU)及EC(0.5μg剂量)、MPT64(0.5μg剂量)、Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)皮肤试验反应24h硬结平均直径[中位数(四分位数)]均大于反应48h[硬结平均直径分别为:9.00(7.00,11.00)mm和6.50(5.50,8.25)mm、13.00(12.75,14.25)mm和9.00(8.00,9.75)mm、9.50(8.50,12.50)mm和8.50(5.50,9.50)mm、8.50(6.25,9.25)mm和5.00(0.00,5.50)mm、6.50(5.50,8.25)mm和3.50(1.50,4.75)mm],差异均有统计学意义(Z值分别为-2.494、-2.677、-2.207、-2.673、-2.670;P值分别为0.013、0.007、0.027、0.008、0.008)。皮肤试验反应24h时,MPT64(0.5μg剂量)、Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)与TB-PPD(5IU)硬结平均直径接近,差异均无统计学意义(H值分别为-0.496、0.819和1.714,P值分别为1.000、1.000和0.865);MPT64(0.5μg剂量)与EC(0.5μg剂量)皮肤试验反应情况接近,差异无统计学意义(H=2.288,P=0.221);Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)硬结平均直径均小于EC(0.5μg剂量),差异均有统计学意义(H值分别为3.795和4.690,P值分别为0.001和0.000)。结论MPT64(0.5μg剂量)和Rv3120(5μg剂量)的豚鼠皮肤试验效果相对较好,对于结核病诊断具有潜在应用价值。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 抗原 皮肤试验 评价研究

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结核性胸腔积液中结核分枝杆菌培养新方法的建立 被引量：1

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作者 杜博平 邢爱英 +9 位作者 刘忠泉 孙琦 贾红彦 魏荣荣 刘洋 曹廷明 杜凤娇 古淑香 马玙 张宗德 《结核病与胸部肿瘤》 2014年第3期172-176,共5页

目的建立结核性胸腔积液中结核分枝杆菌复苏培养的新方法，以期提高临床标本体外培养阳性率，缩短培养时间。方法抽取结核性胸膜炎患者的胸腔积液，离心处理后分别接种于改良罗氏培养基，以及含复苏因子的Middlebrook7Hll固体培养基（... 目的建立结核性胸腔积液中结核分枝杆菌复苏培养的新方法，以期提高临床标本体外培养阳性率，缩短培养时间。方法抽取结核性胸膜炎患者的胸腔积液，离心处理后分别接种于改良罗氏培养基，以及含复苏因子的Middlebrook7Hll固体培养基（简称“7Hll培养基”）和生理盐水（NS）7HII培养基（NS阴性对照组）中，每隔3d观察菌落形成情况，阳性者行抗酸染色（AFB）、PCR扩增试验及DNA测序进行菌种鉴定，观察比较Rpf对Mtb的促进生长作用。利用统计软件SPSS17．0进行统计学分析，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果（1）结核性胸腔积液改良罗氏培养组中的Mtb培养阳性率为16．1％（10／62），含Rpf的7H11培养基中的Mtb培养阳性率为43．5％（27／62），两者比较差异具有显著统计学意义（x2=12．84，P〈0．01），（2）含Rpf7H11培养基的可视菌落形成时间各为（20．924±0．58）d，显著快于NS阴性对照组（不含Rpf）的（38．084±0．94）d（t值分别为10．19，P值均〈0．001）；（3）含Rpf的7H11培养基菌落形成单位数各为（34．125-4．06）×10。，显著多于NS阴性对照组（3．774±0．88）×102（t值分别为5．88，P值均〈0．001）。结论接种结核性胸腔积液后，含Rpf的7H11培养基较改良罗氏培养基可提高Mtb的培养阳性率，缩短培养时间。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 复苏因子 培养

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