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硫霉素生物合成酶基因克隆的研究 被引量：7
1
作者 李戎锋 王以光 曾应 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1993年第1期1-9,共9页
利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y_3。通过对Y_3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S.cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y_3变株恢复产生硫... 利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y_3。通过对Y_3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S.cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y_3变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y_3积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9.8kb左右,插入片段大小为4.5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S.cattleya。 展开更多
关键词 硫霉素 生物合成酶 基因 基因克隆
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硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位 被引量：2
2
作者 李戎锋 王以光 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第1期5-10,共6页
将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BC12转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BC12的转化子细胞抽提液分别与硫霉素生物合成阻断变株Y_3发酵液以及纯化的Y_3中间产物经过体外共培养可产生活性物质,化学分析表明与Y_3发... 将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BC12转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BC12的转化子细胞抽提液分别与硫霉素生物合成阻断变株Y_3发酵液以及纯化的Y_3中间产物经过体外共培养可产生活性物质,化学分析表明与Y_3发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y_3中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质,说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y_3中间产物为底物并弥补了Y_3中的缺陷。对p6BC12中4.5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱。利用含硫霉素环化酶基因的S.lividans TK24转化子体外转化Y_3的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0.9kb Hinc Ⅱ-PstⅠ片段上,并证明了硫霉素环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究硫霉素环化酶基因的结构打下了基础。 展开更多
关键词 硫霉素 抗生素 环化酶基因 基因表达 基因定位
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牲畜链霉菌（Streptomyces　cattleya）thienamycin合成阻断变株的筛选、阻断部位的确定及变株原生质体的研究 被引量：1
3
作者 李戎锋 王以光 《中国抗生素杂志》 CSCD 北大核心 1996年第2期89-93,共5页
以ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ（ＴＮＭ）产生菌Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ为出发菌株，利用终浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ强诱变剂亚硝基胍在ｐＨ９．０、３７℃条件下对其孢子悬液处理３０ｍｉｎ，得到稳定的ＴＮＭ生物合成阻断变株Ｙ＿３。纸层析... 以ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ（ＴＮＭ）产生菌Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ为出发菌株，利用终浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ强诱变剂亚硝基胍在ｐＨ９．０、３７℃条件下对其孢子悬液处理３０ｍｉｎ，得到稳定的ＴＮＭ生物合成阻断变株Ｙ＿３。纸层析后进行茚三酮显迹和生物显迹表明Ｙ＿３变株积累一种无活性中间产物，其迁移率不同于ＴＮＭ。建立了Ｙ＿３变株中间产物的分离纯化方法。酸水解和氨基酸组分分析表明Ｙ＿３中间产物为谷氨酸和丙氨酸组成的二肽，可能是形成碳青霉烯双环母核的底物，提示丙氨酸可能也是ＴＮＭ的前体，Ｙ＿３变株阻断在形成碳青霉烯双环母核的环化步骤。Ｙ＿３变株具有较高的原生质体形成率和再生率。原生质体在４０℃进行处理可以在不影响再生率的前题下提高ＤＮＡ转化率。通过以上研究建立了以Ｙ＿３变株为宿主的ＴＮＭ环化酶基因克隆受体系统。 展开更多
关键词 牲畜链霉菌 阻断变株 原生质体 thienamycin
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Thienamycin环化酶基因的结构及在大肠杆菌中表达的研究
4
作者 李戎锋 王以光 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 1997年第5期321-327,共7页
对来自重组质粒ｐ６ＢＣ１２外源片段上的１．３ｋｂ片段进行核苷酸序列分析，结果表明整个片段的Ｇ＋Ｃ含量为６８．６％，基因结构符合链霉菌基因特点，其上存在一个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ），由４０５个碱基组成，编码１３４个... 对来自重组质粒ｐ６ＢＣ１２外源片段上的１．３ｋｂ片段进行核苷酸序列分析，结果表明整个片段的Ｇ＋Ｃ含量为６８．６％，基因结构符合链霉菌基因特点，其上存在一个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ），由４０５个碱基组成，编码１３４个氨基酸，起始密码为ＡＴＧ，终止密码为ＴＧＡ，起始密码上游有保守的ＳＤ序列ＧＧＡＧＧ。推测的－１０区为ＣＡＧＣＣＴ，－３５区为ＴＴＧＣＡＧ。终止密码下游有一个长为１８ｂｐ的反转重复序列。根据基因定位的结果，认为是ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因。它与异青霉素Ｎ合成酶基因连锁。与Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ中异青霉素Ｎ合成酶及克拉维胺酸合成酶相比氨基酸序列的同源性极低，表明这可能是一个新的基因。利用ＰＣＲ技术将环化酶基因扩增并克隆至大肠杆菌高表达载体ｐＴ７－７，使其在大肠杆菌中得到表达，同位素参入实验结果表明蛋白分子量为１４．５ｋＤ，与理论值相符。表达产物在体外可分别将纯化的ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因阻断变株Ｙ３的中间产物和Ｙ３发酵液转化为具抗菌活性物质。 展开更多
关键词 thienamycin 环化酶 基因表达 抗生素
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牲畜链霉菌异青霉素N合成酶基因的克隆与序列分析 被引量：5
5
作者 王以光 李戎锋 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第2期87-92,共6页
产生含硫卜-内酰胺类抗生素的不同微生物种属间(包括原核和真核)的异青霉素N合成酶(IPNS)基因存在着明显的同源性。利用S. lipmanii IPNS基因探针验证了牲畜链霉菌(S. cattleya)染色体DNA中确实含有与之同源的区带,通过与牲畜链霉菌无... 产生含硫卜-内酰胺类抗生素的不同微生物种属间(包括原核和真核)的异青霉素N合成酶(IPNS)基因存在着明显的同源性。利用S. lipmanii IPNS基因探针验证了牲畜链霉菌(S. cattleya)染色体DNA中确实含有与之同源的区带,通过与牲畜链霉菌无活性阻断突变株互补克隆的方法,获得了同时含有硫霉素环化酶及IPNS基因的重组质粒。经基因序列分析表明牲畜链霉菌中IPNS基因,由963bp组成,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,共编码321个氨基酸,所克隆的牲畜链霉菌IPNS基因编码蛋白与已知的S. clavuligerus的IPNS相似性为56％,与S. lipmanii的IPNS相似性为64％。 展开更多
关键词 牲畜链霉菌 异青霉素N合成酶基因 基因序列分析
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