大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及催化体系优化 被引量：2

1

作者 吴旻晖 梁书利 林影 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2023年第3期75-86,共12页

烟酰胺单核苷酸(NMN)是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽PelB实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Sfnampt)、磷酸核糖焦磷酸激酶(Tkprs)和核糖激酶(Erbks)。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkpr... 烟酰胺单核苷酸(NMN)是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽PelB实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Sfnampt)、磷酸核糖焦磷酸激酶(Tkprs)和核糖激酶(Erbks)。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkprs和Erbks的最适反应温度分别为45、50和37℃,最适pH值分别为7.5、8.5和5.5。热稳定性分析发现,Sfnampt在35℃热稳定性良好而在40~55℃较差;Tkprs在40~60℃热稳定性良好;Erbks在25~40℃热稳定性良好而在45℃较差。酶动力学分析可知,Sfnampt、Tkprs和Erbks的Vmax分别为0.65μmol/(L·min)、2.37μmol/(L·min)、12.58μmol/(L·min),Km分别为2.87μmol/L、25.48μmol/L和74.13μmol/L,Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比底物亲和力好。将分泌表达的三酶用于催化合成NMN,温度37℃、pH值8.0为较优催化条件。底物ATP以及酶Sfnampt在反应体系中为关键因素,经底物和酶配比优化后,使用三酶经过7 h催化可获得5.50μmol/L的NMN。该研究在大肠杆菌系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达,为NMN合成提供了新思路。 展开更多

关键词 烟酰胺单核苷酸 分泌表达 信号肽 大肠杆菌

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鳙鱼肠道菌群多样性及潜在益生菌的分离鉴定 被引量：1

2

作者 秦振宁 肖睿铭 +1 位作者 梁书利 林影 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2023年第5期41-52,共12页

该研究利用三代16S rRNA扩增子测序技术分析天然池塘生境鳙鱼肠道菌群特征,并从中分离潜在益生菌。该生境鳙鱼肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes,10.28%)和变形菌门(Proteobacteria,21.47%)为主。在属水平上,以未命名菌属ZOR006(21.63%)、... 该研究利用三代16S rRNA扩增子测序技术分析天然池塘生境鳙鱼肠道菌群特征,并从中分离潜在益生菌。该生境鳙鱼肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes,10.28%)和变形菌门(Proteobacteria,21.47%)为主。在属水平上,以未命名菌属ZOR006(21.63%)、严格梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1,10.84%)、罗姆布茨菌属(Romboutsia,10.34%)、类梭菌属(Paeniclostridium,9.63%)、甲基孢囊菌属(Methylocystis,8.74%)为主。为分离到既有利于营养物质的吸收又能抑制病原微生物的鳙鱼源芽孢杆菌(Bacillus),对从该生境鳙鱼肠道中分离的菌株进行产酶、抑菌等功能相关益生特性试验。试验共分离出3株细菌,YB6、YB42和YB56,通过菌落形态观察及16S rRNA序列分析,鉴定结果显示其分别为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis strain)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis strain)和解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)。试验结果表明,3株菌均具有良好的产胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及抑制病原菌的能力,可以作为促消化和病原拮抗益生菌做进一步的研究。 展开更多

关键词 鳙鱼 肠道菌群 益生菌 芽孢杆菌 分离

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米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达 被引量：11

3

作者 徐苏炜 林影 +2 位作者 韩振林 梁书利 韩双艳 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期10-14,共5页

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛... 脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。 展开更多

关键词 米黑根毛霉 脂肪酶 毕赤酵母 分泌表达

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烟酰胺磷酸核糖转移酶在大肠杆菌中的表达及催化合成烟酰胺单核苷酸 被引量：6

4

作者 廖一波 吴旻晖 +1 位作者 梁书利 林影 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2021年第2期87-93,182,共8页

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt)是生物酶法合成烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide ribotide,NMN)中重要的酶,催化烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)合... 烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt)是生物酶法合成烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide ribotide,NMN)中重要的酶,催化烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)合成NMN。本研究将来源Meiothermus ruber的Nampt在大肠杆菌系统进行胞内表达,表达产物经纯化后进行酶学性质分析,并进一步将其用于催化合成NMN。将重组菌株在16℃低温下进行摇瓶水平诱导21 h,收集发酵菌体并进行超声破碎,破碎后上清利用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,SDS-PAGE结果显示表达与纯化后的产物大小约55 ku,与预期的蛋白分子量相符。重组Nampt的最适反应温度为45℃,最适p H为6。酶动力学分析显示,该酶对底物NAM催化的Km、Vmax、kcat分别是0.39μmol/L、3.20μmol/(mg·min)、1.391/s。使用该酶催化生产NMN,通过反应中补加一次底物PRPP,反应10min产物NMN产量可达30 mg/L。本研究成功表达一个酶学性质和热稳定性优良的Nampt,并将其应用在单酶催化生产NMN时有较高的产量和生产效率,为生物酶法合成NMN的应用研究奠定了基础。 展开更多

关键词 烟酰胺磷酸核糖转移酶 烟酰胺单核苷酸 大肠杆菌

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不同陈化期烤烟叶表细菌的多样性及发育分析 被引量：17

5

作者 伍雪莹 梁书利 +2 位作者 韩双艳 陈小敏 林影 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第18期28-33,38,共7页

为了全面了解陈化烟叶细菌多样性,以进一步挖掘其中的有益微生物,利用16S rRNA克隆文库测序分析技术,鉴定和比较了曲靖烟区陈化时间分别为24、36、48个月的烤烟烟叶上的细菌多样性。结果在陈化24、36、48个月的烟叶上分别鉴定得到55、60... 为了全面了解陈化烟叶细菌多样性,以进一步挖掘其中的有益微生物,利用16S rRNA克隆文库测序分析技术,鉴定和比较了曲靖烟区陈化时间分别为24、36、48个月的烤烟烟叶上的细菌多样性。结果在陈化24、36、48个月的烟叶上分别鉴定得到55、60、23个细菌的操作分类单元(OTU),其中肠杆菌科、假单胞菌科和黄杆菌科的细菌占优势。在不同陈化阶段,菌群的多样性和优势菌有所不同,烟叶上细菌的多样性在陈化后期逐渐减低。研究结果展示了烟叶陈化期间细菌的菌群结构和动态变化,发现了一些能够减少烟叶有害物质的细菌,是烟叶上的有益细菌筛选的重要参考。 展开更多

关键词 烟叶 细菌 16S-rRNA克隆文库 多样性 发育分析

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坚忍肠球菌6-24和枯草芽孢杆菌B9对罗氏沼虾免疫水平与肠道环境的改善作用 被引量：8

6

作者 朱成坤 秦振宁 +2 位作者 韩双艳 梁书利 林影 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2021年第3期23-31,153,共10页

本研究通过抑菌试验、粘附性实验和特定水解酶活测定,结合16S rDNA和生理生化鉴定,从虾肠道中分离出坚忍肠球菌(Enterococcus durans)6-24和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B9,并初步研究他们在饲喂罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii... 本研究通过抑菌试验、粘附性实验和特定水解酶活测定,结合16S rDNA和生理生化鉴定,从虾肠道中分离出坚忍肠球菌(Enterococcus durans)6-24和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B9,并初步研究他们在饲喂罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的益生作用。两株菌按1×10^(7)cfu/kg添加到饲料并进行为期4周的投喂实验后,本研究测定了罗氏沼虾的总血球细胞,酚氧化酶原系统(proPO),抗氧化系统以及溶菌酶变化情况。研究结果显示,罗氏沼虾投喂含有6-24和B9的饲料后,血淋巴中总血球细胞计数(total haemocyte count)显著提高(p<0.05),酚氧化酶(phenol oxidase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)以及溶菌酶(lysozyme)的活性同时也有所提高(p<0.05),其中酚氧化酶上升48.24%,溶菌酶上升198.00%。罗氏沼虾肠道消化酶的影响实验显示,添加混合益生菌的实验组虾肠道消化酶(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶)的活性与对照组相比有显著提高(p<0.05),其中蛋白酶活力更是上升84.80%。最后,研究还发现,饲喂坚忍肠球菌6-24和枯草芽孢杆菌B9后,罗氏沼虾肠道中可培养弧菌数量下降59.76%(p<0.05)。研究结果表明,坚忍肠球菌6-24与枯草芽孢杆菌B9能在一定程度上改善罗氏沼虾的肠道环境和免疫水平,具有虾饲用益生菌开发的潜力。 展开更多

关键词 益生菌 发酵饲料 罗氏沼虾 生长性能 免疫 肠道环境

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常压室温等离子体(ARTP)诱变选育高核酸酿酒酵母 被引量：14

7

作者 李小坤 王旺 +1 位作者 林影 梁书利 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2018年第12期137-144,238,共9页

核糖核酸(RNA)是一类非常重要的生物分子,降解后得到的核苷酸、核苷及碱基具有广泛用途。酿酒酵母是目前生产RNA的主要食品级微生物。本研究采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行酿酒酵母诱变育种,利用氯化钾敏感性筛选,多次反复诱变最... 核糖核酸(RNA)是一类非常重要的生物分子,降解后得到的核苷酸、核苷及碱基具有广泛用途。酿酒酵母是目前生产RNA的主要食品级微生物。本研究采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行酿酒酵母诱变育种,利用氯化钾敏感性筛选,多次反复诱变最终得到在以糖蜜为碳源的摇瓶试验中RNA含量为112 mg-RNA/g-DCW,提高了39%的突变菌株Y17aM3。经过对Y17aM3培养条件优化后,确定生产RNA最适接种量为10%,最适p H为5.5,最适温度为26℃,且传代稳定性良好。研究发现在最佳培养条件下,添加磷酸可使Y17aM3的RNA含量提高至119 mg-RNA/g-DCW;添加蛋白胨可使Y17aM3的RNA含量提高至122 mg-RNA/g-DCW。上述结果不仅证明ARTP诱变育种方法突变效果显著,可应用于工业微生物的选育,而且有助于降低基于核苷酸的食品添加剂的生产成本。 展开更多

关键词 酿酒酵母 ARTP 氯化钾 RNA 诱变选育

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表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的重组毕赤酵母高密度发酵条件优化 被引量：3

8

作者 冯琮 林影 +2 位作者 梁书利 苏国栋 韩双艳 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期29-34,共6页

以Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵工艺手册为依据,先用摇瓶模拟甘油分批发酵,确定了表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticlipase B,CALB)的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需几种重要配方的最佳浓度为:甘油含量40g/L、硫酸铵4... 以Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵工艺手册为依据,先用摇瓶模拟甘油分批发酵,确定了表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticlipase B,CALB)的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需几种重要配方的最佳浓度为:甘油含量40g/L、硫酸铵4g/L、PTM14mL/L和CaSO410mmol/L;然后利用多功能补料摇床确定了菌株最适生长和产酶的pH分别为5.5和7.0,最适生长和产酶温度为30℃;再在2L发酵罐上放大,并对甘油流加模式和甲醇流加模式进行了优化筛选,确定了以9.6mL/(L.h)的流速流加甘油12h能有效提高菌体密度;以6.4mL/(L.h)的流速恒速流加甲醇比恒定溶氧流加甲醇诱导产酶更佳。最终单位菌体酶活力可达348.4U/g,比甘油含量40g/L、硫酸铵10g/L、PTM14.35mL/L、CaSO40.93g/L,以6.4mL/(L.h)的流速流加甘油4h和以恒定溶氧流加甲醇的未优化条件下提高34.8%。最后通过细胞表面荧光强度检测和全细胞催化合成活力对比,发现优化后单位菌体展示的蛋白表达量得到提高。 展开更多

关键词 发酵优化 酵母表面展示 南极假丝酵母脂肪酶B 高密度

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毕赤酵母全细胞催化合成新型高倍甜味剂莱鲍迪苷A 被引量：3

9

作者 唐小雁 陈美琪 +1 位作者 林影 梁书利 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2020年第1期150-155,共6页

本研究构建经密码子优化后的UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶AtSUS基因的重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9KUGT/p PICZA-At SUS,实现双酶在毕赤酵母中的胞内共表达。利用共表达菌株作为全细胞催化剂在体外进行催化反应,可成功将ST转化为... 本研究构建经密码子优化后的UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶AtSUS基因的重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9KUGT/p PICZA-At SUS,实现双酶在毕赤酵母中的胞内共表达。利用共表达菌株作为全细胞催化剂在体外进行催化反应,可成功将ST转化为RA,并在此基础上对其最适反应温度、反应p H、底物UDP浓度与底物蔗糖浓度条件进行优化。重组菌株经甲醇诱导,对不同发酵时间菌体的催化能力进行探究,确定发酵120 h菌体催化能力最佳,RA产量为0.58 mg/mL。对共表达菌株催化体系中全细胞催化条件进行优化,优化后的催化体系为:反应pH 7.0,UDP浓度1 mM,蔗糖浓度70 mM,MgCl2浓度3 mM,ST浓度10 mg/mL,将OD600为30的细胞与上述体系混合后在最适温度45℃下,200 r/min反应15 h,重组菌可将10 mg/mL ST转化为7.46 mg/mL RA,为RA酶法生物合成及其产业化应用提供技术支持。 展开更多

关键词 UDP-葡糖基转移酶 蔗糖合成酶 毕赤酵母 莱鲍迪苷A

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黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B催化仲醇动力学拆分 被引量：2

10

作者 李远锋 张锟 +3 位作者 韩双艳 郑穗平 梁书利 林影 《化学与生物工程》 CAS 2018年第5期53-58,共6页

光学活性仲醇是合成多种生物活性化合物的原料和关键中间体,微生物细胞表面展示酶在生物催化和生物转化制备生化产品等方面表现出良好的应用性。研究了黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)制备的全细... 光学活性仲醇是合成多种生物活性化合物的原料和关键中间体,微生物细胞表面展示酶在生物催化和生物转化制备生化产品等方面表现出良好的应用性。研究了黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)制备的全细胞催化剂(AN-CALB)动力学拆分仲醇的催化性能。以2-辛醇作为反应底物,研究了酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比、AN-CALB添加量、水活度、温度及溶剂对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响,确定最优反应条件为:以乙酸异丙烯酯为酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比1∶1、AN-CALB添加量50 g·L-1、水活度0.11、温度45℃、以甲苯为溶剂,在此条件下,反应12 h的底物转化率达47.4%,eep值为99.6%,E值大于600。在最优反应条件下,AN-CALB对8种仲醇均表现出较好的拆分效果,底物转化率最高接近50%。该研究为仲醇动力学拆分提供了新的催化剂选择。 展开更多

关键词 南极假丝酵母脂肪酶B 细胞表面展示 黑曲霉 全细胞催化剂 仲醇 动力学拆分

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体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶高效催化合成莱鲍迪苷A 被引量：2

11

作者 朱清娟 陈美琪 +2 位作者 梁书利 王登刚 林影 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2021年第1期47-53,64,共8页

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生... 本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。 展开更多

关键词 UDP-葡糖基转移酶 蔗糖合成酶 毕赤酵母 莱鲍迪苷A

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一种通过过表达毕赤酵母翻译相关因子提高重组蛋白胞内表达的策略 被引量：1

12

作者 林雯炀 廖锡豪 +5 位作者 陈南柱 黄大富 陈亮 钟炳旭 梁书利 林影 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2021年第7期66-73,共8页

本研究为筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有促进作用的翻译相关因子,扩增了毕赤酵母中包括核糖体蛋白翻译起始因子、翻译延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、核糖体生物合成因子、核糖体分子伴侣五类翻译相关因子(共28个)的基因片段,并将上述基因... 本研究为筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有促进作用的翻译相关因子,扩增了毕赤酵母中包括核糖体蛋白翻译起始因子、翻译延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、核糖体生物合成因子、核糖体分子伴侣五类翻译相关因子(共28个)的基因片段,并将上述基因片段与质粒pPICZA进行同源重组,进一步获得重组载体后分别转化至以增强型绿色荧光蛋白eGFP为报告蛋白的毕赤酵母中。之后通过测量计算120 h内28个过表达翻译相关因子菌株的荧光蛋白表达量,筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有潜在促进作用的因子,进一步以红色荧光蛋白mRFP为报告蛋白进行验证。结果表明:本研究共筛选到了6个对毕赤酵母重组蛋白胞内表达有促进作用的翻译相关因子eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Bcy1、Ssb。其中eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Bcy1、Ssb的eGFP单位菌体表达量分别增加了18.40%、18.80%、29.50%、28.45%、21.60%,mRFP单位菌体表达量分别增加了20.00%、8.00%、19.00%、5.40%、15.40%。Bcy1使得eGFP表达菌株生物量增加20.00%,mRFP表达菌株生物量增加30.90%。为从翻译层面提高毕赤酵母重组蛋白表达提供了思路。 展开更多

关键词 毕赤酵母 翻译相关因子 重组蛋白 胞内表达

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大肠杆菌植酸酶AppA在毕赤酵母中的高效表达

13

作者 高娇 郑学云 +1 位作者 林影 梁书利 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2019年第12期137-144,共8页

本研究全基因合成大肠杆菌B48来源的植酸酶App A基因,并将它克隆到PHKA载体上,在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。为了进一步提高毕赤酵母中植酸酶的表达量,本研究结合信号肽、启动子、基因剂量和蛋白质折叠通量优化的方法,最终将毕赤酵... 本研究全基因合成大肠杆菌B48来源的植酸酶App A基因,并将它克隆到PHKA载体上,在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。为了进一步提高毕赤酵母中植酸酶的表达量,本研究结合信号肽、启动子、基因剂量和蛋白质折叠通量优化的方法,最终将毕赤酵母中植酸酶的活力从329.41 U/m L提高到了1892.51 U/m L,是初始菌株的5.75倍。初步测定了植酸酶App A的基本酶学性质,其最适温度和p H分别为60℃和4.5;在60℃处理60 min后,植酸酶活力剩余40%,温度稳定性较差;在pH 6.0~7.0处理6 h后,酶活力剩余87%,该酶在弱酸环境中有较好的稳定性;同时研究了二价金属离子对植酸酶活力的影响,Fe^2+能够激活植酸酶App A的活力,而Cu^2+、Ni^2+、Mn^2+等离子通过与植酸形成络合物而抑制植酸酶App A的活力。该酶在酸性条件下的强稳定性有利于将其应用于食品加工领域。 展开更多

关键词 毕赤酵母 植酸酶 表达元件 基因剂量 调控因子

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毕赤酵母强启动子P_(CAT1)的改造及转录因子结合位点分析

14

作者 农璐源 梁书利 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2021年第4期72-78,71,共8页

本研究通过随机突变对毕赤酵母甲醇诱导型强启动子PCAT1进行改造,以绿色荧光蛋白为表征,经过高通量筛选,获得一个活性范围为25.57%~138.12%的PCAT1启动子库;通过测序发现活性提高了38.12%的PCAT1变体6-39在5’-3’方向上的-118bp处的碱... 本研究通过随机突变对毕赤酵母甲醇诱导型强启动子PCAT1进行改造,以绿色荧光蛋白为表征,经过高通量筛选,获得一个活性范围为25.57%~138.12%的PCAT1启动子库;通过测序发现活性提高了38.12%的PCAT1变体6-39在5’-3’方向上的-118bp处的碱基由A突变为了G。用转录因子结合位点在线预测软件Mat Inspector分析该PCAT1变体的转录因子结合位点变化,发现该PCAT1变体与野生型的PCAT1相比,F$YMCM结合位点减少,并且F$CSRE和F$YGAL结合位点增多。接着,用Mat Inspector分析16种毕赤酵母甲醇利用途径基因启动子的转录因子结合位点,发现转录因子F$CSRE结合位点在甲醇诱导型启动子中分布广泛,F$YGAL结合位点仅在组成型的启动子中分布广泛,推测F$CSRE结合位点的增多最有可能提高PCAT1的甲醇诱导活性,为毕赤酵母甲醇利用途径基因启动子关键位点解析提供参考。 展开更多

关键词 毕赤酵母 启动子 随机突变 转录因子结合位点

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类芽孢杆菌碱性果胶裂解酶Pel在毕赤酵母中的高效表达 被引量：6

15

作者 刘晓肖 郑学云 +2 位作者 梁书利 韩双艳 林影 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2015年第11期74-79,共6页

本研究全基因合成了来源于类芽孢杆菌的碱性果胶酶基因pel,克隆至p HKA载体上,成功实现其在毕赤酵母GS115中的分泌表达;并对信号肽和启动子进行优化,使得摇瓶发酵诱导168 h果胶裂解酶酶活达到432.36 U/m L。初步测定了果胶裂解酶Pel的... 本研究全基因合成了来源于类芽孢杆菌的碱性果胶酶基因pel,克隆至p HKA载体上,成功实现其在毕赤酵母GS115中的分泌表达;并对信号肽和启动子进行优化,使得摇瓶发酵诱导168 h果胶裂解酶酶活达到432.36 U/m L。初步测定了果胶裂解酶Pel的基本酶学性质,其最适反应温度和p H分别为60℃、10.0;在50℃下处理300 min裂解酶活力保留90%以上,而在60℃下处理210 min,酶活力剩余约50%;在p H 9~12的50 m M各缓冲液中处理酶液16 h,酶活力仍然保留90%以上,该酶耐碱性强,但在偏酸性缓冲液中处理该酶,酶活力有所下降;同时研究了二价金属离子对果胶裂解酶活性力的影响,Ca^(2+)对Pel发挥裂解作用是必需的,Fe^(2+)、Mg^(2+)、Ni^(2+)对Pel均有激活作用,而金属离子螯合物EDTA的存在则使酶活力完全丧失;该酶在碱性条件下较好的稳定性决定了其潜在的工业应用前景。 展开更多

关键词 毕赤酵母 果胶裂解酶 异源表达 启动子 信号肽

原文传递

烟叶表面微生物群落结构鉴定及其产酶分析 被引量：11

16

作者 陈小敏 林影 梁书利 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1760-1766,共7页

为分析"黑老虎"烟叶表面微生物群落及其产酶情况,基于PE:2×300 bp测序策略利用Illumina Miseq平台对以不同调制方式处理的"黑老虎"烟叶进行16S r DNA高通量测序,并用水解圈平板分析微生物产木聚糖酶、纤维素... 为分析"黑老虎"烟叶表面微生物群落及其产酶情况,基于PE:2×300 bp测序策略利用Illumina Miseq平台对以不同调制方式处理的"黑老虎"烟叶进行16S r DNA高通量测序,并用水解圈平板分析微生物产木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶的能力。3个样品共获得346 060条有效序列,组装成303个、228个和196个OTU。主要细菌类群为厚壁菌门(Firmicutes)下的芽孢杆菌(Bacillus)、变形菌门(Proteobacteria)下的假单胞菌(Pseudomonadaceae)及放线菌门(Actinobacteria)下的微球菌(Micrococcaceae)。85株分离的细菌多数能产多种酶,产果胶酶和木聚糖酶能力较强,产蛋白酶和淀粉酶次之,而产纤维素酶能力稍弱。芽孢杆菌是"黑老虎"烟叶表面最主要的菌群,而假单胞菌可能是刷米浆调制工艺赋予烟叶独特风味的重要菌群。所分离出的产酶微生物在烟草加工上有作为微生物菌剂实现提质增香的应用潜力。 展开更多

关键词 烟草微生物 群落结构 16S rDNA高通量测序 酶活

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共表达透明颤菌血红蛋白提高脂肪酶在毕赤酵母中的表达 被引量：4

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作者 卢俊裕 林影 +1 位作者 梁书利 叶燕锐 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2014年第6期110-115,共6页

为了克服巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中的溶氧限制,提高外源蛋白的表达量,本文以启动子YPT介导透明颤菌血红蛋白(VHb)在培养过程中组成型表达。同时以启动子AOX1介导的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因作为报告基因,使CALB在甲醇诱导阶... 为了克服巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中的溶氧限制,提高外源蛋白的表达量,本文以启动子YPT介导透明颤菌血红蛋白(VHb)在培养过程中组成型表达。同时以启动子AOX1介导的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因作为报告基因,使CALB在甲醇诱导阶段表达。另外,还将绿色荧光蛋白在过氧化物表面表达,将红色荧光蛋白在过氧化物基质中表达以检测信号肽能否定位在相应的位置。最后,将VHb分别在过氧化物酶体表面和基质两个位置表达,以观察表达位置的不同所产生的影响。通过SDS-PAGE和Western Blot分析表明,CALB和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在限氧条件下,重组菌株GS115/ExVHb、GS115/VHbSKL的外源蛋白CALB的表达量比对照菌株GS115/CALB分别提高了27.57%和20.52%。这说明VHb与外源基因共表达可以改善酵母在发酵过程中的摄氧情况,提高外源蛋白的表达量。 展开更多

关键词 透明颤菌血红蛋白 脂肪酶 氧限制 毕赤酵母 分泌表达

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黑曲霉组成型表面展示南极假丝酵母脂肪酶B及其发酵调控 被引量：4

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作者 李远锋 靳珅 +3 位作者 王登刚 梁书利 郑穗平 林影 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1189-1196,共8页

黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)可有效应用于食品、化妆品、医药等行业。以黑曲霉Aspergillus niger SH-1为宿主细胞构建诱导型糖化酶基因启动子表面展示CALB,在较高浓度葡萄糖碳源的发酵中CALB表达会受到抑制,发酵后期菌体... 黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)可有效应用于食品、化妆品、医药等行业。以黑曲霉Aspergillus niger SH-1为宿主细胞构建诱导型糖化酶基因启动子表面展示CALB,在较高浓度葡萄糖碳源的发酵中CALB表达会受到抑制,发酵后期菌体容易出现菌丝断裂和展示酶活力下降等问题。采用组成型3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子替代诱导型糖化酶基因启动子的细胞表面展示CALB黑曲霉菌株可有效解决上述问题,该菌株不但可以利用葡萄糖,而且还能利用木糖为发酵碳源,以木糖为碳源发酵在144 h展示酶水平达到1 100.28 U/g。文中探讨了甘蔗渣水解液发酵生产黑曲霉表面展示CALB,初步达到预期的结果,为甘蔗渣的综合利用提供了新途径。 展开更多

关键词 黑曲霉 脂肪酶 细胞表面展示 组成型启动子

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快速筛选高效表达重组蛋白毕赤酵母菌株新方法的建立及评价 被引量：5

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作者 陈永安 袁清焱 +2 位作者 李承 梁书利 林影 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期939-949,共11页

毕赤酵母是当前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,文中建立了一种快速筛选高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株的新方法。首先,对内质网转膜蛋白Sec63融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的改造菌株GS115-E表达重组蛋白的能力进行检测;之后... 毕赤酵母是当前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,文中建立了一种快速筛选高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株的新方法。首先,对内质网转膜蛋白Sec63融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的改造菌株GS115-E表达重组蛋白的能力进行检测;之后将携带不同拷贝数的植酸酶phy基因或木聚糖酶xyn基因的质粒转化进入GS115-E中,得到具有不同植酸酶或木聚糖酶表达水平的重组菌株,分别检测不同菌株的EGFP与重组蛋白的表达水平;最后,利用分选型流式细胞仪,根据绿色荧光值的高低对包含不同植酸酶表达水平的重组菌株的菌群进行分选。结果显示重组菌株中EGFP的荧光值与重组蛋白的活性表达水平之间具有良好的线性相关性(0.8<|R|<1),且利用流式细胞仪可高效地从混合菌群中筛选得到高产菌株,所分选得到的高荧光菌株在摇瓶发酵120 h时植酸酶表达水平是低荧光菌株的4.09倍。本方法通过检测菌株的EGFP荧光值代替检测重组蛋白的表达水平和活性,从而实现高表达菌株的筛选,大大提高了其应用的便捷性及通用性。与流式细胞仪、液滴微流控等高通量筛选仪器或技术结合将进一步提高筛选的速度与通量,为筛选获得高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株提供了简便、快速的新途径。 展开更多

关键词 毕赤酵母 高通量筛选 重组蛋白表达 内质网标签蛋白

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恶臭假单胞杆菌肌酐酶在大肠杆菌中的表达及其酶学特性分析 被引量：2

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作者 侯赣生 林影 梁书利 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2017年第9期77-82,共6页

肌酐酶(Creatininase)是肌酐酶法检测的一个关键酶,将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)肌酐酶基因(Cre)克隆至原核表达载体p ET-28a(+),通过IPTG的诱导,实现了肌酐酶Cre在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的可溶性表达。表达产物... 肌酐酶(Creatininase)是肌酐酶法检测的一个关键酶,将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)肌酐酶基因(Cre)克隆至原核表达载体p ET-28a(+),通过IPTG的诱导,实现了肌酐酶Cre在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的可溶性表达。表达产物经60℃加热处理、Ni-NTA亲和层析和Sephadex G-200分子筛层析,分离纯化出重组肌酐酶,回收率为29.3%,其比酶活达到489.17 U/mg,是已有文献中报道中的最高水平。进一步进行酶学特性分析,结果表明其最适反应温度为60℃,50℃以下可以稳定保存,具有良好的热稳定性;最适p H值为7.0,在p H 7.0~8.0条件下比较稳定;Cu2+会抑制肌酐酶的活性;Mn2+、Zn2+和Co2+对肌酐酶有明显的激活作用;EDTA、SDS、Tween-20、Tween-80和Trinton-100几乎对酶活力没影响;Na N3不影响酶的活力。以肌酸为底物时,酶动力学常数Km值为47.38 mmol/L。本研究在大肠杆菌系统成功实现肌酐酶的可溶性表达,进行分离纯化并测定其酶学性质,为肌酐酶的表达和潜在工业化应用提供理论基础。 展开更多

关键词 恶臭假单胞杆菌 肌酐酶 大肠杆菌 酶学特性

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