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嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞体外培养体系及慢病毒侵染条件的优化 被引量：1
1
作者 王红霞 潘俊斐 +6 位作者 蒋丹 屈昱良 李艳宁 李光琪 楚元奎 张晓春 徐广贤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期390-397,共8页
目的优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件。方法CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细... 目的优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件。方法CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细胞介素2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-18、rhIL-7、rhIL-21、TWS119。分别于第0、3、5、7、10、18天进行细胞计数检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达,ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)释放,优化T细胞体外培养体系。采用(0、20、50)μg/mL重组人纤连蛋白(RetroNectin^■),(250、500、1000)ng/mL抗人CD3/CD28抗体包被培养板,以感染复数(MOI)=3、5的阴性对照慢病毒侵染T细胞72 h,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,初步判断病毒侵染效率;流式细胞术检测CD3/GFP阳性率,以获得慢病毒侵染条件。包装CD19 CAR慢病毒,实时荧光定量PCR、Western blot法检测是否成功构建CD19 CAR慢病毒载体,采用以上优化的病毒侵染条件及T细胞培养体系,包括建立rhIL-2、rhIL-12联合rhIL-18培养体系,使用1μg/mL抗人CD3/CD28,20μg/mLRetroNectin^■包被培养板,制备CD19 CAR-T细胞。结果细胞增殖能力较佳体系为rhIL-2联合rhIL-18,IFN-γ释放最强体系为rhIL-2、rhIL-12联合rhIL-18。抗CD3/CD28抗体剂量为1μg/mL,RetroNectin^■20μg/mL,MOI为3时病毒侵染效率最优。该优化条件下CAR-T细胞阳性率达34%。结论获得优化的CD19 CAR-T细胞体外培养体系及慢病毒侵染原代T细胞条件。 展开更多
关键词 增殖 活化 脐带血 嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞
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驼源天然纳米抗体噬菌体展示库的构建及抗CD19纳米抗体的筛选、表达及鉴定 被引量：3
2
作者 李光琪 李艳宁 +4 位作者 楚元奎 张爱君 潘俊斐 王红霞 徐广贤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1036-1043,共8页
目的构建驼源天然纳米抗体噬菌体展示文库并进行验证,用于筛选针对不同抗原的纳米抗体,并以CD19为抗原筛选靶向纳米抗体,进行表达并验证。方法对提取的双峰驼脾脏总RNA进行反转录并通过巢式PCR获得其重链可变区基因片段,构建至pCANTAB5... 目的构建驼源天然纳米抗体噬菌体展示文库并进行验证,用于筛选针对不同抗原的纳米抗体,并以CD19为抗原筛选靶向纳米抗体,进行表达并验证。方法对提取的双峰驼脾脏总RNA进行反转录并通过巢式PCR获得其重链可变区基因片段,构建至pCANTAB5e噬菌粒载体中,电转化至TG1大肠杆菌构建纳米抗体噬菌体展示库,以辅助噬菌体KM13进行救援后,分析库容及多样性。以CD19为抗原,采用生物素化抗原与链霉亲和素磁珠相结合的方法进行纳米抗体的淘筛,对淘筛后的单克隆进行ELISA鉴定、测序、分析、表达和验证。结果构建的纳米抗体噬菌体展示库有较好的多样性,片段插入率接近100%,随机挑取的20个克隆中其氨基酸同源性为65.85%,经辅助噬菌体救援后展示库滴度为9.0×10^13集落形成单位(CFU)/mL。对以CD19为抗原淘筛后获得的阳性克隆进行测序分析,并对纳米抗体进行表达与验证,结果显示具有与CD19结合的能力。结论成功构建滴度高、多样性好的驼源天然纳米抗体噬菌体展示库,以CD19为抗原进行淘筛获得三条抗CD19纳米抗体序列,为研究以CD19为靶标的诊断试剂盒以及抗体药物提供技术支持,为制备靶向CD19的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞提供基础。 展开更多
关键词 纳米抗体 噬菌体展示技术 CD19
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噬菌体纳米抗体展示库构建中电转化条件的优化
3
作者 李艳宁 李光琪 +4 位作者 屈昱良 潘俊斐 楚元奎 张晓春 徐广贤 《宁夏医科大学学报》 2021年第5期481-485,共5页
目的对DNA电转化条件进行优化,以达到高的转化效率。方法测定不同生长阶段的大肠杆菌TG1、不同电压、不同外源基因(噬菌体质粒pCANTAB5e与驼源VHH片段的连接产物)质量、T4 DNA连接酶去除前后及转化孵育后不同培养温度等条件下的电转化效... 目的对DNA电转化条件进行优化,以达到高的转化效率。方法测定不同生长阶段的大肠杆菌TG1、不同电压、不同外源基因(噬菌体质粒pCANTAB5e与驼源VHH片段的连接产物)质量、T4 DNA连接酶去除前后及转化孵育后不同培养温度等条件下的电转化效率,寻找最适电转化条件。结果当大肠杆菌TG1处于生长对数期(OD600为0.4左右)时制备电感受态细胞,取用乙醇沉淀法去除T4 DNA连接酶后的0.7μg连接产物,在电压2.3 kV、电容25μF、电阻200Ω的条件下,采用0.2 cm的电击杯进行电转化,将获得高的转化效率,达7.9×10^(7)CFU/μg DNA,而转化后的培养温度(30℃和37℃)对电转化效率并没有明显影响。结论经优化电转化条件后得到了高的电转化效率,为构建抗体库奠定基础。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 电转化 转化效率
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人艰难梭菌毒素B抗原表位抗体的制备及其ELISA检测方法的建立 被引量：1
4
作者 潘俊斐 张爱君 +4 位作者 李刚 王红霞 李艳宁 李光琪 徐广贤 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第3期285-290,297,共7页
目的制备人艰难梭菌TcdB抗原表位抗体,建立针对人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA检测方法。方法通过生物信息学等方法预测人艰难梭菌TcdB蛋白的抗原表位,固相多肽合成法合成抗原并制备抗体Anti-TcdB1和Anti-TcdB2,ELISA检测效价并验证其... 目的制备人艰难梭菌TcdB抗原表位抗体,建立针对人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA检测方法。方法通过生物信息学等方法预测人艰难梭菌TcdB蛋白的抗原表位,固相多肽合成法合成抗原并制备抗体Anti-TcdB1和Anti-TcdB2,ELISA检测效价并验证其特异性。用辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)标记TcdB2抗体,建立ELISA双抗体夹心法。利用棋盘滴定法筛选一抗最佳包被浓度、最佳样品稀释倍数及最适二抗工作浓度等条件,优化ELISA检测方法并确定临界值,用已知阳性、阴性标本及重组B蛋白验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。结果间接ELISA确定Anti-TcdB1的效价为1∶512000,抗TcdB2抗体为1∶2048000。棋盘滴定等方法确定ELISA一抗最佳包被浓度0.5μg/ml,样品最佳稀释倍数1∶2,酶标抗体最佳稀释度为1∶20000。该诊断方法特异,不与其它肠道细菌感染出现交叉反应;重组B蛋白最低检测限为32.25ng/ml;试验的重复性良好,批内和批间变异系数均小于10%。结论本研究建立的检测人艰难梭菌TcdB的ELISA双抗体夹心法敏感、特异,重复性良好,可用于鉴别产毒素B艰难梭菌。 展开更多
关键词 酶联免疫吸附试验 抗原表位抗体 艰难梭菌毒素B
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双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建及抗GDH纳米抗体筛选 被引量：5
5
作者 方媛 徐广贤 +2 位作者 王羡 王红霞 潘俊斐 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期49-56,共8页
目的构建噬菌体天然纳米抗体展示库,以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台,并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原筛选靶向GDH的纳米抗体,对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证。方法采用OligoDT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行... 目的构建噬菌体天然纳米抗体展示库,以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台,并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原筛选靶向GDH的纳米抗体,对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证。方法采用OligoDT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行反转录,通过巢氏PCR获取全套重链可变区基因,将其构建到噬菌粒pCANTAB5E载体,经多次电转化至E.coilTG1构建初级噬菌体抗体库,经辅助噬菌体拯救后构成噬菌体展示库,并对噬菌体展示库的库容及多样性进行分析和鉴定。同时以GDH为靶向抗原对文库进行淘筛,计算淘筛回收率,并对第三轮淘筛后平板的单克隆进行ELISA鉴定。结果构建的天然噬菌体纳米抗体库的插入率为95%左右,随机挑取的9个克隆氨基酸同源性为66.17%,经MEGA分析后具有较好的多样性,同时经辅助噬菌体拯救后,得到的噬菌体展示库滴度为4×1012CFU/ml。在三轮淘筛过程中,回收率逐步升高,噬菌体得到了有效的富集,同时对阳性克隆进行测序及分析,最终得到2条抗GDH纳米抗体序列。结论成功构建了双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库且多样性良好,为后续筛选其他的靶向抗原奠定了基础,同时筛选获得两条抗GDH纳米抗体序列,为制备艰难梭菌谷氨酸脱氢酶诊断抗体提供技术支撑。 展开更多
关键词 纳米抗体 噬菌体展示技术 艰难梭菌谷氨酸脱氢酶
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lncRNA Tmevpg1对小鼠自噬和JAK-STAT信号通路关键信号分子表达水平的影响 被引量：4
6
作者 王羡 王红霞 +3 位作者 潘俊斐 方媛 郭乐 徐广贤 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2019年第7期1308-1319,共12页
该文主要研究lncRNA Tmevpg1对小鼠自噬和JAK-STAT信号通路关键信号分子等相关分子表达水平的影响。该研究利用生物信息学分析构建Tmevpg1、JAK-STAT信号通路及自噬互作调控网络;雷帕霉素(rapamycin, Rapa)和氯喹(chloroquine, CQ)构建... 该文主要研究lncRNA Tmevpg1对小鼠自噬和JAK-STAT信号通路关键信号分子等相关分子表达水平的影响。该研究利用生物信息学分析构建Tmevpg1、JAK-STAT信号通路及自噬互作调控网络;雷帕霉素(rapamycin, Rapa)和氯喹(chloroquine, CQ)构建小鼠自噬模型;通过细胞共培养技术构建Tmevpg1过表达与干扰细胞模型;qRT-PCR(quantitative real-time PCR)检测小鼠脾脏和细胞模型中Tmevpg1等相关分子的RNA水平, Western blot检测自噬相关蛋白、T-bet和JAKSTAT通路关键信号分子磷酸化蛋白表达水平。结果显示, Tmevpg1、IFN-γ、T-bet、STAT1和JAK1在自噬发生的一定时间点内显著上调(P<0.001);过表达Tmevpg1后ULK1表达上调(P<0.05), p62下调(P<0.05), IFN-γ、T-bet、JAK1以及STAT1表达未发生明显改变,而干扰Tmevpg1后IFN-γ、T-bet、JAK1以及STAT1表达减少(P<0.05);Western blot结果显示小鼠自噬模型构建成功, T-bet、p-STAT1和p-JAK1表达趋势与m RNA水平一致;过表达Tmevpg1可上调ULK1和LC3-Ⅱ,下调p62,同时干扰Tmevpg1后T-bet、p-JAK1和p-STAT1表达水平下降。该项研究结果表明, lncRNA Tmevpg1和JAKSTAT信号通路对细胞自噬发挥重要调控作用。 展开更多
关键词 自噬 lncRNA JAK-STAT信号通路
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