甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达 被引量：1

1

作者 牟旭鹏 韦安慧 +2 位作者 申茉函 孔宁 颜炜群 《中国老年学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期617-619,共3页

目的将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株。方法通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI和KpnI酶切消化后连接,... 目的将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株。方法通过RT-PCR扩增HSA基因,构建pPICZα-HSA质粒,将人工合成的M2e序列与pPICZα-HSA质粒分别经BstBI和KpnI酶切消化后连接,构建真核表达载体pPICZα-HSA/M2e,线性化后电转化毕赤酵母X-33。用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDS-PAGE和Western印迹法筛选高表达HSA/M2e菌株。结果经RT-PCR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致,构建的pPICZα-HSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆。SDS-PAGE和Western印迹分析证实了甲醇诱导的培养基上清中含有HSA/M2e,分子量约为68kD。结论成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。 展开更多

关键词 甲型流感病毒 M2e 血清白蛋白 毕赤酵母

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人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

2

作者 牟旭鹏 孔宁 +3 位作者 申茉函 韩东 张林 颜炜群 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期755-758,共4页

目的:克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法:从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正... 目的:克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法:从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正确的重组质粒用SacI线性化后电转化至毕赤酵母X-33,经PCR法、SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物,从而筛选出能够稳定、高效分泌表达hbFGF的酵母工程菌。结果:经测序证实获得的hbFGF序列与GenBank(登录号NM002006)报道的完全一致,甲醇诱导表达后培养液上清的SDS-PAGE凝胶电泳显示在相对分子质量约18000有一蛋白条带,Western blotting结果显示表达产物与抗人碱性成纤维细胞生长因子抗体产生特异性条带,证明rhbFGF蛋白的表达。结论:成功克隆了hbFGF基因,并在毕赤酵母体系中进行了表达。 展开更多

关键词 成纤维细胞生长因子2 毕赤酵母 逆转录聚合酶链反应

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白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达 被引量：5

3

作者 杨莉莉 贺巾超 +5 位作者 董文 范伟全 凡炼炼 潘秦 牟旭鹏 颜炜群 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期17-20,共4页

目的:探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法:将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti,电击转化毕赤酵母菌株X-33,用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛... 目的:探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法:将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti,电击转化毕赤酵母菌株X-33,用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果:转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI;培养上清中rBPTI含量约200 mg.L-1;SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508;rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致;胰蛋白酶活性抑制分析结果表明,抑制常数Ki=(2.6±0.1)×10-9,与天然BPTI一致。结论:hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg.L-1。 展开更多

关键词 牛胰蛋白酶抑制剂 白蛋白信号肽 毕赤酵母

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水曲柳皮总香豆素提取工艺研究 被引量：3

4

作者 陈玉娟 张宏桂 +3 位作者 孙严彤 王会堂 贺丽鹏 牟旭鹏 《时珍国医国药》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期3-4,共2页

目的筛选水曲柳总香豆素的最佳提取工艺。方法采用正交实验设计L9(34)考察浸渍时间,乙醇浓度,水浴温度,提取时间4个因素对提取工艺的影响。结果水曲柳中总香豆素含量的最佳工艺为水曲柳粗粉加25倍量95%乙醇,室温超声提取45 min。结论优... 目的筛选水曲柳总香豆素的最佳提取工艺。方法采用正交实验设计L9(34)考察浸渍时间,乙醇浓度,水浴温度,提取时间4个因素对提取工艺的影响。结果水曲柳中总香豆素含量的最佳工艺为水曲柳粗粉加25倍量95%乙醇,室温超声提取45 min。结论优选的超声提取条件工艺简单,成本低,节能省时,可增加水曲柳的利用率。 展开更多

关键词 水曲柳 白蜡树精 正交实验 总香豆素

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rhTRAIL对小鼠乳腺癌的抑制作用 被引量：3

5

作者 陈伟莉 牟旭鹏 +2 位作者 马杰 刘韦 颜炜群 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期480-483,共4页

目的:探讨重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)对小鼠乳腺癌的抑制作用。方法:将5×109cells/L对数生长期的小鼠乳腺癌细胞D2F2接种于BALB/c小鼠右上肢皮下,每只接种0.2mL(1×106个细胞),随机分为5组。空白对照组:PBS0... 目的:探讨重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)对小鼠乳腺癌的抑制作用。方法:将5×109cells/L对数生长期的小鼠乳腺癌细胞D2F2接种于BALB/c小鼠右上肢皮下,每只接种0.2mL(1×106个细胞),随机分为5组。空白对照组:PBS0.2mL;rhTRAIL低、中、高剂量组:剂量分别为2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg;阳性药物组:环磷酰胺30.0mg/kg。各组均采用腹腔注射,每天1次,共15d。每天小鼠称重记录,每3d观察肿瘤的生长情况并用游标卡尺测定肿瘤的长径和短径,计算肿瘤体积和抑瘤率。停药后处死小鼠,取瘤进行肿瘤组织光镜和电镜观察。同时流式细胞仪检测经不同浓度rhTRAIL作用后细胞凋亡及细胞周期变化。结果:与空白对照组相比,rhTRAIL2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg(低、中、高)剂量组的肿瘤重量和体积明显低于空白对照组(P<0.01),且rhTRAIL低、中、高剂量组的肿瘤重量和体积随药物浓度的增加而降低(P<0.01)。rhTRAIL2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg(低、中、高)剂量组肿瘤细胞既有坏死也有凋亡样改变,肿瘤组织破坏面积大,很多区域看不到正常的肿瘤细胞,可见凋亡小体。流式细胞仪检测结果显示rhTRAIL蛋白可诱导D2F2细胞凋亡,0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L组细胞凋亡率分别为7.56%、21.37%、27.16%,凋亡率随剂量增大而升高(P<0.05)。结论:rhTRAIL可诱导小鼠乳腺癌细胞D2F2凋亡并有大量的乳腺癌细胞坏死,rhTRAIL对小鼠乳腺癌细胞D2F2具有抑制作用。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 乳腺肿瘤 细胞凋亡

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人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达 被引量：2

6

作者 孔宁 牟旭鹏 +3 位作者 韩冬 马杰 陈伟莉 颜炜群 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期42-45,共4页

目的:在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M(rhOSM)。方法:以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能... 目的:在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M(rhOSM)。方法:以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果:经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28000的rhOSM,表达量为45mg·L-1。结论:毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45mg·L-1。 展开更多

关键词 重组人抑瘤素M 分泌表达 毕赤酵母

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rhTRAIL对黑色素瘤A-375细胞凋亡的影响 被引量：2

7

作者 陈伟莉 牟旭鹏 +3 位作者 班磊 刘韦 申茉函 颜炜群 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期565-568,F0002,共5页

目的:研究重组人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rhTRAIL)对黑色素瘤A-375细胞生长及诱导细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法:将培养的黑色素瘤A-375细胞分为对照组和rhTRAIL低、中、高剂量组(0.25、0.50、1.00mg·L-1),经不... 目的:研究重组人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rhTRAIL)对黑色素瘤A-375细胞生长及诱导细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法:将培养的黑色素瘤A-375细胞分为对照组和rhTRAIL低、中、高剂量组(0.25、0.50、1.00mg·L-1),经不同剂量rhTRAIL作用后,观察细胞形态;MTT法检测细胞存活分数;TUNEL法检测细胞凋亡率;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化。结果:对照组细胞呈梭形贴壁或半贴壁生长,rhTRAIL组一部分细胞变圆,贴壁不佳,细胞数低于对照组。与对照组比较,rhTRAIL明显抑制黑色素瘤A-375的生长,1.00mg·L-1组的生长抑制率最高,0.50mg·L-1组次之,0.25mg·L-1组最低,3组间比较差异有显著性(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,rhTRAIL蛋白可诱导A-375细胞凋亡,rhTRAIL低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为6.68%、24.59%和28.91%,且凋亡率随剂量增大而升高,3组间比较差异有显著性(P<0.05)。rhTRAIL低、中、高剂量组细胞处于G1期的百分率(45.26%、60.67%和69.10%)明显高于对照组(37.41%)(P<0.05)。结论:rhTRAIL对A-375细胞生长有显著的抑制作用,呈剂量依赖性,其机制可能与细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡有关。 展开更多

关键词 黑色素瘤 TRAIL 细胞凋亡}细胞周期

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重组人碱性成纤维细胞生长因子在大豆毛状根中的表达 被引量：1

8

作者 陈伟莉 范伟全 +5 位作者 张新民 刘楠 韦安慧 孔宁 牟旭鹏 颜炜群 《中国老年学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期945-947,共3页

目的利用基因重组技术在大豆毛状根中表达hbFGF。方法将hbFGF基因克隆到pCambia1301载体,以大豆子叶节和下胚轴为外植体,通过发根农杆菌C58C1介导转入到大豆中。经潮霉素抗性筛选,PCR法检测hbFGF基因的整合。用Western blot印迹分析hbFG... 目的利用基因重组技术在大豆毛状根中表达hbFGF。方法将hbFGF基因克隆到pCambia1301载体,以大豆子叶节和下胚轴为外植体,通过发根农杆菌C58C1介导转入到大豆中。经潮霉素抗性筛选,PCR法检测hbFGF基因的整合。用Western blot印迹分析hbFGF的表达。结果阳性毛状根中整合并表达了hbFGF基因。结论克隆hbFGF基因并转染到大豆的毛状根中,在毛状根中表达。 展开更多

关键词 碱性成纤维细胞生长因子 大豆 转化 发根农杆菌 毛状根

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重组人β-淀粉样蛋白1-42在毕赤酵母中的表达与鉴定 被引量：1

9

作者 申茉函 王全才 +3 位作者 牟旭鹏 陈洪波 牛超 颜炜群 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期1083-1085,共3页

目的:探索在毕赤酵母中表达人β-淀粉样蛋白1-42(hAβ1-42)的可行性。方法:以含有hAβ1-42基因的质粒为模板,采用PCR方法扩增所需DNA片段,与毕赤酵母表达载体pPICZα连接,构建重组质粒pPICZα-hAβ1-42并进行DNA测序分析。将其电击转化... 目的:探索在毕赤酵母中表达人β-淀粉样蛋白1-42(hAβ1-42)的可行性。方法:以含有hAβ1-42基因的质粒为模板,采用PCR方法扩增所需DNA片段,与毕赤酵母表达载体pPICZα连接,构建重组质粒pPICZα-hAβ1-42并进行DNA测序分析。将其电击转化毕赤酵母菌株X-33,经SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物。结果:经测序证实,获得的hAβ1-42序列与基因合成的完全一致。SDS-PAGE显示,在约4000处有一蛋白带,Western blotting证明表达产物与抗hAβ1-42抗体有特异性免疫反应。结论:本研究在毕赤酵母中成功地重组表达hAβ1-42。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 Β-淀粉样蛋白 毕赤酵母 表达

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HER2/neu ECD毕赤酵母工程菌大规模发酵工艺研究 被引量：1

10

作者 韩冬 徐煌 +3 位作者 牟旭鹏 孔宁 颜炜群 关铭 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期146-149,共4页

采用补料分批培养方法,在80 L发酵罐中对HER2/neu ECD工程菌进行高密度发酵,发酵温度28℃,pH值为4.4,溶氧范围25%以上。在湿重值达到180 g/L时开始诱导,甲醇诱导体积分数为0.5%,发酵时间96 h。发酵液离心后,上清经阳离子交换层析,对其... 采用补料分批培养方法,在80 L发酵罐中对HER2/neu ECD工程菌进行高密度发酵,发酵温度28℃,pH值为4.4,溶氧范围25%以上。在湿重值达到180 g/L时开始诱导,甲醇诱导体积分数为0.5%,发酵时间96 h。发酵液离心后,上清经阳离子交换层析,对其表达产物进行纯化。结果表明:在优化发酵条件下,发酵上清通过阳离子交换层析纯化,可获得纯度较高的重组HER2/neu ECD,产量为600 mg/L。 展开更多

关键词 HER2/neuECD 毕赤酵母 发酵

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毛状根在植物次生代谢产物生产方面应用的研究进展 被引量：9

11

作者 陈伟莉 牟旭鹏 刘冬影 《黑河学院学报》 2010年第4期122-126,共5页

毛状根培养是生产植物次生代谢产物的新途径、新方法。对毛状根培养生产次生代谢产物的技术特点、毛状根诱导的分子机理以及利用毛状根生物反应器大规模生产植物次生代谢产物的研究进展进行阐述,为利用毛状根培养技术大规模生产有用药... 毛状根培养是生产植物次生代谢产物的新途径、新方法。对毛状根培养生产次生代谢产物的技术特点、毛状根诱导的分子机理以及利用毛状根生物反应器大规模生产植物次生代谢产物的研究进展进行阐述,为利用毛状根培养技术大规模生产有用药物提供参考。 展开更多

关键词 毛状根 次生代谢产物 大规模生产 生物反应器

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禽流感病毒感染K-562和HL-60肿瘤细胞系的实验研究 被引量：1

12

作者 张红梅 赵丹 +2 位作者 吴玫 牟旭鹏 周伯平 《中国实验诊断学》 2013年第8期1375-1379,共5页

目的选择代表不同骨髓细胞分化阶段的血液肿瘤细胞株K-562、HL-60作为研究对象,选取低致病性禽流感病毒H3N2/H4N6作为病原体,探讨禽流感病毒感染骨髓的机制。方法应用流式细胞术检测K562等细胞表面禽流感病毒受体;收集感染病毒的细胞培... 目的选择代表不同骨髓细胞分化阶段的血液肿瘤细胞株K-562、HL-60作为研究对象,选取低致病性禽流感病毒H3N2/H4N6作为病原体,探讨禽流感病毒感染骨髓的机制。方法应用流式细胞术检测K562等细胞表面禽流感病毒受体;收集感染病毒的细胞培养上清,红细胞凝集实验检测染毒细胞释放的子代病毒;收集感染病毒的细胞免疫荧光检测病毒NP,判断病毒吸附、进入细胞并在细胞内增殖、复制情况。结果所检测细胞表面均有禽流感病毒SAα2,3-Gal和SAα2,6-Gal连接的唾液酸寡糖受体的表达。在H3N2感染的K-562细胞培养上清中检测到病毒HA,且随培养时间的延长,病毒的血凝滴度增大。在H4N6感染的K-562细胞的培养上清中病毒HA检测阳性,第三天,K-562细胞上清的病毒血凝滴度即达4,第四天达16;HL-60细胞,只在第三、四天达2;随后荧光显微镜下观察可见,染毒细胞培养0h时,胞膜、胞浆内即可见病毒分布,H4N6感染的细胞荧光强度大于H3N2感染的细胞;H3N2和H4N6感染的细胞中,K562细胞的荧光强度大于其他细胞。随着培养时间的延长,K562细胞表面的病毒增多,而HL-60细胞无明显变化。结论 K-562、HL-60细胞表面均表达禽流感病毒SA-α2,3Gal和SA-α2,6Gal连接的唾液酸寡糖受体。同一病毒H3N2或H4N6的吸附、繁殖和复制及释放情况存在较大差异。 展开更多

关键词 禽流感病毒 骨髓 低致病性 受体 植物凝集素

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影响禽流感病毒(H3N2/H4N6)感染机制的生物信息学分析 被引量：1

13

作者 张红梅 赵丹 +2 位作者 吴玫 牟旭鹏 周伯平 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第8期1078-1083,共6页

目的通过生物信息学分析禽流感病毒WDK/ST/27/03（H3N2）和Dk/ST/472/03（H4N6）HA、NA氨基酸序列,进一步探讨影响禽流感病毒感染血液肿瘤细胞株K-562和HL-60的机制。方法 RT-PCR扩增WDK/ST/27/03（H3N2）和Dk/ST/472/03（H4N6）HA、NA... 目的通过生物信息学分析禽流感病毒WDK/ST/27/03（H3N2）和Dk/ST/472/03（H4N6）HA、NA氨基酸序列,进一步探讨影响禽流感病毒感染血液肿瘤细胞株K-562和HL-60的机制。方法 RT-PCR扩增WDK/ST/27/03（H3N2）和Dk/ST/472/03（H4N6）HA、NA基因,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,对纯化的PCR产物进行测序。在GenBank中选取登录的H3N2和H4N6序列,利用在线生物信息工具ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）对这些序列和WDK/ST/27/03（H3N2）和Dk/ST/472/03（H4N6）HA、NA氨基酸序列进行比对分析。结果 RT-PCR扩增产物的大小与预期相符。生物信息学分析显示,WDK/ST/27/03（H3N2）HA的裂解位点是QNR＊GLFG,Dk/ST/472/03（H4N6）HA的裂解位点是KAAR＊GLFG,此位置的氨基酸无变化。HA的226位氨基酸为Gln（Q）,228位氨基酸为Gly（G）,具有禽流感病毒HA受体结合位点的特征,影响受体结合的位点98Y、136S、152W、183H、190E、194L、222W、225G、227S未见变异。NA活性位点及影响酶活的位点均无变异,但WDK/ST/27/03（H3N2）NA在接近N-末端的茎部61~79位缺失19个氨基酸,致使NA茎部变短,且丢失2个潜在的糖基化位点。结论 WDK/ST/27/03（H3N2）的NA茎部缺失突变可能是造成其吸附、繁殖和复制能力低于Dk/ST/472/03（H4N6）的一个因素。 展开更多

关键词 流感病毒 血细胞凝集素 神经氨酸酶 生物信息学

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人碱性成纤维细胞生长因子在植物毛状根和毕赤酵母中的表达

14

作者 范伟全 牟旭鹏 +2 位作者 韦安慧 刘永刚 张宏桂 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第6期577-580,585,共5页

目的在植物毛状根和毕赤酵母中表达人碱性成纤维细胞生长因子(Human basic fibroblast growth factor,hbFGF),并对发酵条件进行优化。方法将hbFGF基因分别克隆至表达载体pCAMBIA1301和pPICZα上,构建重组表达质粒pCAMBIA1301-hbFGF和pP... 目的在植物毛状根和毕赤酵母中表达人碱性成纤维细胞生长因子(Human basic fibroblast growth factor,hbFGF),并对发酵条件进行优化。方法将hbFGF基因分别克隆至表达载体pCAMBIA1301和pPICZα上,构建重组表达质粒pCAMBIA1301-hbFGF和pPICZα-hbFGF。通过发根农杆菌介导,将pCAMBIA1301-hbFGF质粒转入大豆毛状根;采用电转化法将质粒pPICZα-hbFGF转入毕赤酵母X-33菌株,PCR法筛选阳性转化子,诱导表达。筛选高效稳定表达株,发酵培养并优化发酵条件,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并进行纯化。结果经酶切及测序证明两个重组表达质粒构建正确;经PCR鉴定证明hbFGF基因已整合入大豆毛状根及毕赤酵母基因组中;筛选出了在两种体系中发酵培养的最佳条件;hbFGF在大豆毛状根和毕赤酵母中的表达量分别占总蛋白的31%和42%,且均具有良好的反应原性;经纯化后,均可见相对分子质量约18000的单一条带。结论 hbFGF能够在大豆毛状根和毕赤酵母中高效表达,为其大规模工业化生产奠定了实验基础。 展开更多

关键词 碱性成纤维细胞生长因子2 毛状根 毕赤酵母 发酵

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