抗人hnRNP A1单克隆抗体的制备及在颅咽管瘤组织中的应用 被引量：1

1

作者 王穗海 赵玉梅 +3 位作者 黄湘 潘华政 李明 姚小艳 《热带医学杂志》 CAS 2008年第3期209-211,216,F0003,共5页

目的制备核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNP A1)的单克隆抗体,探讨hnRNP A1蛋白的生物学功能。方法利用重组hnRNP A1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/... 目的制备核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNP A1)的单克隆抗体,探讨hnRNP A1蛋白的生物学功能。方法利用重组hnRNP A1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗hnRNPA1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western Blot和免疫组织化学实验等方法分别对其效价和特异性进行鉴定。结果成功地建立了3株稳定分泌抗hnRNPA1的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E006、E009和E012。3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。3株单克隆抗体通过组织化学实验和Western Blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的hnRNPA1蛋白。结论获得了效价高、特异性好的抗hnRNP A1蛋白的单克隆抗体,这为进一步研究hnRNP A1的生物学功能及它在癌发生事件中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 HNRNP AL 抗体 单克隆 组织化学 肿瘤

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过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响 被引量：10

2

作者 黄湘 谭家余 +1 位作者 王穗海 李明 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期120-125,共6页

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建p... 目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 HSPC238 过表达 BEL7402 细胞周期

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抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定 被引量：4

3

作者 黄湘 潘华政 +3 位作者 王穗海 赵玉梅 谭家余 李明 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期180-183,共4页

目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果... 目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和B001。检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶256,腹水效价为1∶25600和1∶32000。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 PSMA7蛋白 杂交瘤 抗体 单克隆

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新趋化因子VCC-1小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定 被引量：3

4

作者 牟霞 陈瑶 +2 位作者 王穗海 黄湘 李明 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期734-736,共3页

目的构建对VCC-1基因有特异性抑制作用的小干扰RNA(siRNA)表达载体。方法根据VCC-1 mRNA序列,按照siRNA设计原则设计4条特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中。酶切鉴定和测序验证阳性克隆。用脂质体转染SMMC7... 目的构建对VCC-1基因有特异性抑制作用的小干扰RNA(siRNA)表达载体。方法根据VCC-1 mRNA序列,按照siRNA设计原则设计4条特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中。酶切鉴定和测序验证阳性克隆。用脂质体转染SMMC7721细胞,以RT-PCR分析其对VCC-1 mRNA表达的影响。结果经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功。pGPU6/GFP/Neo-siRNA、B、C、D载体均能抑制SMMC7721细胞VCC-1基因mRNA的表达,其中重组质粒C抑制作用最强。结论成功构建了靶向人VCC-1的小干扰RNA表达载体,为进一步研究VCC-1的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 VCC-1 小干扰RNA表达载体 SMMC7721细胞 RNA干扰

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实时荧光定量PCR检测乳腺癌5种多药耐药基因的表达强度 被引量：4

5

作者 曾爱华 何蕴韶 +1 位作者 李虎 王穗海 《陕西医学杂志》 CAS 北大核心 2005年第2期135-137,163,共4页

目的 :检测 5种多药耐药基因在乳腺癌细胞株 MCF- 7和 MCF- 7/ADR里的表达强度变化 ,为乳腺癌多药耐药逆转研究提供新的思路。方法 :通过实时荧光定量 PCR技术分别检测乳腺癌敏感细胞株 MCF- 7和耐药细胞株 MCF- 7/ADR里的 mdr1、MRP、L... 目的 :检测 5种多药耐药基因在乳腺癌细胞株 MCF- 7和 MCF- 7/ADR里的表达强度变化 ,为乳腺癌多药耐药逆转研究提供新的思路。方法 :通过实时荧光定量 PCR技术分别检测乳腺癌敏感细胞株 MCF- 7和耐药细胞株 MCF- 7/ADR里的 mdr1、MRP、L RP、GST- π、TOPO α基因表达强度。结果 :MCF- 7/ADR里的 mdr1、MRP、LRP、GST- π基因表达强度分别比它们在 MCF- 7里的表达强度相对增加了 1 2 5 .39、5 5 .5 3、1 .2 4、3.38倍 ,TOPO α则降低了 0 .43倍 ,其中 mdr1、MRP表达强度的相对增加倍数均显著高于 L RP、GST- π、TOPO α的增加 (或降低 )倍数 ( P<0 .0 0 1 )。结论 :除了 mdr1之外 ,MRP也可能在乳腺癌的多药耐药产生机制里起重要作用。因此 展开更多

关键词 乳腺癌 mdr1 MCF-7 表达 多药耐药基因 LRP GST-Π 加倍 倍数 结论

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间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定 被引量：4

6

作者 孙莉 郝文波 +2 位作者 吴英松 王穗海 李明 《热带医学杂志》 CAS 2008年第3期198-200,共3页

目的在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性。方法将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重... 目的在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性。方法将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,ELISA检测血清效价,Western-blotting鉴定其免疫活性。结果重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,经复性、纯化后免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测效价为1∶51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应,而不能与正常人起交叉反应。结论PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。 展开更多

关键词 恶性疟原虫 乳酸脱氢酶 表达 免疫活性

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lncRNA UCA1靶向调控p21对黑色素瘤细胞增殖、侵袭的影响 被引量：3

7

作者 闫璐 邱贤文 +5 位作者 王穗海 魏姗姗 黄东兰 谭锐 李鹏飞 关志广 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期162-167,182,共7页

目的探讨长链非编码RNA尿路上皮癌相关1(UCA1)在黑色素瘤组织和细胞中的表达及其介导的肿瘤细胞增殖和侵袭行为。方法采用实时荧光定量PCR检测UCA1在黑色素瘤组织和3种黑色素瘤细胞株(M21、B16、A375)中的表达情况;利用siRNA技术敲低M21... 目的探讨长链非编码RNA尿路上皮癌相关1(UCA1)在黑色素瘤组织和细胞中的表达及其介导的肿瘤细胞增殖和侵袭行为。方法采用实时荧光定量PCR检测UCA1在黑色素瘤组织和3种黑色素瘤细胞株(M21、B16、A375)中的表达情况;利用siRNA技术敲低M21、A375细胞UCA1的表达,MTT法检测细胞增殖能力,Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡率;Real-time PCR和Western blot检测敲低M21、A375细胞UCA1表达后p21表达变化情况。结果 UCA1在黑色素瘤组织和黑色素瘤细胞株(M21、B16、A375)中表达明显高于正常皮肤色素痣组织和正常黑色素细胞HEM,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。将UCA1 siRNA(si-UCA1)分别转染至黑色素瘤细胞M21和A375,与对照组(si-NC)比较,si-UCA1组增殖活性明显降低,G_0/G_1期细胞比例明显升高,细胞凋亡率明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。M21和A375细胞的si-UCA1组穿膜细胞数和迁移细胞数明显低于si-NC组(均P<0.01)。p21 mRNA在黑色素瘤组织表达明显低于正常皮肤色素痣组织,差异具有统计学意义(P<0.01);相关分析显示,黑色素瘤组织UCA1与p21 mRNA表达呈显著负相关(r=-0.291,P<0.01)。敲低M21和A375细胞中UCA1表达明显升高p21 mRNA和蛋白表达水平,而转染p21 siRNA则显著降低由si-UCA1诱导的p21表达(均P<0.01)。结论长链非编码RNA UCA1在黑色素瘤中高表达,UCA1可能通过靶向调控p21参与黑色素瘤细胞的增殖和侵袭。 展开更多

关键词 长链非编码RNA 尿路上皮癌相关1 黑色素瘤 增殖 侵袭

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抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定 被引量：3

8

作者 黄湘 王穗海 +3 位作者 潘华政 赵玉梅 牟霞 李明 《热带医学杂志》 CAS 2008年第4期288-290,312,共4页

目的制备抗HSPC238的单克隆抗体,为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western-blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立... 目的制备抗HSPC238的单克隆抗体,为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western-blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E001和E002。ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1∶12800和1∶25600。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。通过Western-blot实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白。结论成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体,制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定,为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 LOC51255 HSPC238蛋白 杂交瘤 单克隆抗体

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抗RalB单克隆抗体的制备及初步应用 被引量：2

9

作者 潘华政 黄湘 +4 位作者 姚小艳 王穗海 杜红岩 季朝能 李明 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期651-653,670,共4页

目的制备抗Ras相关蛋白RalB的单克隆抗体(McAb),探讨RalB蛋白在哺乳动物真核细胞中的表达,为进一步研究RalB功能奠定基础。方法以纯化的原核表达RalB蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞与Sp2/0融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得... 目的制备抗Ras相关蛋白RalB的单克隆抗体(McAb),探讨RalB蛋白在哺乳动物真核细胞中的表达,为进一步研究RalB功能奠定基础。方法以纯化的原核表达RalB蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞与Sp2/0融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗RalB蛋白的McAb的杂交瘤细胞株。通过免疫组织化学方法和Western-blot方法分别对RalB在组织中的表达及特异性进行鉴定。结果获得2株能高效分泌特异性McAb的抗RalB的杂交瘤细胞系F001,F002,其免疫球蛋白亚类均为IgG1。免疫组织化学实验结果表明RalB定位于肝癌细胞的细胞膜,Western-blot显示RalB在不同的肝癌细胞及正常肝细胞中均有表达。结论成功获得抗RalB的特异性的单克隆抗体,为进一步研究RalB与肿瘤的相关功能研究创造了条件。 展开更多

关键词 RalB蛋白 单克隆抗体 真核细胞 表达

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抗STARD7单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：3

10

作者 潘华政 黄湘 +2 位作者 王穗海 季朝能 李明 《热带医学杂志》 CAS 2008年第1期1-3,共3页

目的制备抗STARD7(START domain containing 7,transcript variant 1)的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),探讨STARD7蛋白在哺乳动物真核细胞中的表达,为进一步研究STARD7功能奠定基础。方法以纯化的原核表达STARD7蛋白免疫的BALB/... 目的制备抗STARD7(START domain containing 7,transcript variant 1)的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),探讨STARD7蛋白在哺乳动物真核细胞中的表达,为进一步研究STARD7功能奠定基础。方法以纯化的原核表达STARD7蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞与Sp2/0融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗STARD7蛋白的McAb的杂交瘤细胞株。采用McAb通过Western blot方法对STARD7效价和特异性进行鉴定。结果获得2株能高效分泌特异性McAb的抗STARD7的杂交瘤细胞系W001、W003,其免疫球蛋白亚类均为IgG1。Western blot结果表明抗STARD7单克隆抗体能特异性识别真核细胞中的STARD7蛋白。结论成功获得抗STARD7的特异性的单克隆抗体,为进一步研究STARD7与肿瘤的相关功能研究创造了条件。 展开更多

关键词 STARD7蛋白 单克隆抗体 真核细胞

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VCC－1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定 被引量：2

11

作者 牟霞 陈瑶 +2 位作者 王穗海 黄湘 李明 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期79-81,共3页

目的:构建pcDNA3.1(-)/VCC-1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC-7721中。方法:以SMMC-7721细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增VCC-1基因编码区cDNA,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。... 目的:构建pcDNA3.1(-)/VCC-1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC-7721中。方法:以SMMC-7721细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增VCC-1基因编码区cDNA,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR及Western blot检测转染前后该细胞株VCC-1基因的表达。结果:pcDNA3.1(-)/VCC-1经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR及West-ern blot检测,重组质粒转染株的VCC-1基因的表达水平高于对照组,证实VCC-1基因稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达。结论:成功地建立了人基因VCC-1的肝癌细胞SMMC-7721稳定转染株,为进一步研究VCC-1的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 VCC-1 载体构建 转染

原文传递

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达 被引量：1

12

作者 黄湘 潘华政 +2 位作者 王穗海 赵玉梅 李明 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期181-182,185,共3页

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达。方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。... 目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达。方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平。结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达。结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础。 展开更多

关键词 真核表达质粒 SMMC-7721 XAPC7 构建 表达

原文传递

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定 被引量：1

13

作者 黄湘 谭家余 +3 位作者 乔亚峰 王穗海 邱玉林 李明 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1462-1465,共4页

目的构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列,将它与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3... 目的构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列,将它与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。 展开更多

关键词 UBE2C 真核表达质粒 CHANG LIVER 构建 表达

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RNA干扰对乳腺癌细胞株MCF-7/Adr多药耐药性的逆转 被引量：1

14

作者 曾爱华 何蕴韶 +2 位作者 王穗海 王伟毅 钟女奇 《江苏医药》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期365-367,共3页

目的研究小分子干扰RNA对乳腺癌耐药细胞株MCF7/Adr多药耐药性的逆转作用。方法设计针对mdrl基因的SiRNA,转染进MCF-7/Adr细胞;用荧光定量PCR检测mdrlmRNA的表达,流式细胞仪分析Pgp表达,MTT法检测阿霉素对MCF-7/Adr细胞的半数抑制浓度(I... 目的研究小分子干扰RNA对乳腺癌耐药细胞株MCF7/Adr多药耐药性的逆转作用。方法设计针对mdrl基因的SiRNA,转染进MCF-7/Adr细胞;用荧光定量PCR检测mdrlmRNA的表达,流式细胞仪分析Pgp表达,MTT法检测阿霉素对MCF-7/Adr细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果该SiRNA能使耐药细胞株MCF-7/Adr的mdrlmRNA和Pgp表达水平分别显著下调(P<0.01),并使阿霉素对MCF7/Adr的IC50显著降低(P<0.01)。结论RNA干扰可逆转乳腺癌MCF7/Adr细胞株的多药耐药性。 展开更多

关键词 RNA干扰 乳腺癌细胞株 MCF-7 Adr 多药耐药性 乳腺癌耐药细胞

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人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10在大肠埃希菌中的诱导表达与鉴定 被引量：1

15

作者 杜红延 杨学习 +3 位作者 马奎 黄湘 王穗海 李明 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期166-168,共3页

目的构建稳定表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C/UbcH10)蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导其表达,纯化并鉴定该重组蛋白。方法通过PCR扩增获得UbcH10基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体,经EcoRI/XhoI双酶切及... 目的构建稳定表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C/UbcH10)蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导其表达,纯化并鉴定该重组蛋白。方法通过PCR扩增获得UbcH10基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体,经EcoRI/XhoI双酶切及测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达4h。采用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,用Ni-Sepharose亲和层析和Sephadex G-50分子筛纯化UbcH10蛋白。结果成功构建UbcH10基因的原核表达载体,经IPTG诱导后在大肠埃希菌BL21中获得大量重组蛋白。该重组蛋白以可溶形式表达,表观分子量约为29kD,表达量约占菌体蛋白总量的40%。Western blotting检测在29kD附近出现预期条带,与目的蛋白的理论计算值相吻合。纯化后的UbcH10蛋白终浓度为8.82mg/ml,纯度达90%以上。结论成功表达并纯化了UbcH10重组蛋白,为进一步研究其结构、功能以及该蛋白在肿瘤发生发展过程中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 泛素蛋白连接酶类 原核表达 克隆 分子

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抗人半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2单克隆抗体的制备和鉴定 被引量：1

16

作者 赵玉梅 徐伟文 +4 位作者 王穗海 黄湘 潘华政 李明 季朝能 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期201-203,共3页

目的制备半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(Cysteine and glycine-rich protein 2,CRP2)的单克隆抗体,探讨CRP2蛋白的生物学功能。方法利用重组CRP2蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行常规融合,... 目的制备半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(Cysteine and glycine-rich protein 2,CRP2)的单克隆抗体,探讨CRP2蛋白的生物学功能。方法利用重组CRP2蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行常规融合,通过间接ELISA筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗CRP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western-blot和免疫共沉淀实验等方法对其特性进行鉴定。结果成功地建立了2株稳定分泌抗CRP2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为F001和F002。两株单克隆抗体与重组抗原有较强的特异性反应。同时,两株单克隆抗体通过Western-Blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的CRP2蛋白,并且,两株抗体都可以应用于免疫共沉淀实验。结论获得了效价高、特异性好的CRP2蛋白的单克隆抗体,为CRP2的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 蛋白质类 单克隆抗体 杂交瘤 免疫沉淀

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PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备 被引量：1

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作者 赵玉梅 王穗海 +2 位作者 潘华政 黄湘 李明 《热带医学杂志》 CAS 2008年第3期201-204,共4页

目的蛋白酶体激活亚单位3(PA28γ)的表达、纯化及其多克隆抗体的制备。方法利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA28γ蛋白,经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体;将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),诱导表达PA28γ蛋白,通过Glutathi... 目的蛋白酶体激活亚单位3(PA28γ)的表达、纯化及其多克隆抗体的制备。方法利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA28γ蛋白,经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体;将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),诱导表达PA28γ蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白(GST-PA28γ);并用其免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,对表达产物和多抗血清进行Western-blot鉴定。结果成功构建原核表达质粒PA28γ/pGEX-4T-1,且测序正确;获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清,并得到Western-blot证实。结论成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清,为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 PA28γ 原核表达 纯化 多克隆血清

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RalB在多种肿瘤细胞中的表达及意义

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作者 潘华政 黄湘 +2 位作者 王穗海 杜红延 李明 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期302-303,共2页

目的探讨RalB(v-ral simian leukemia viral oncogene homolog B,ras related;GTP binding protein)蛋白在多种肿瘤细胞中的表达及意义。方法以人胚肾293T细胞为正常细胞对照,选用8种不同组织的肿瘤细胞,采用抗RalB的单克隆抗体通过West... 目的探讨RalB(v-ral simian leukemia viral oncogene homolog B,ras related;GTP binding protein)蛋白在多种肿瘤细胞中的表达及意义。方法以人胚肾293T细胞为正常细胞对照,选用8种不同组织的肿瘤细胞,采用抗RalB的单克隆抗体通过Western blot方法检测其RalB蛋白的表达。结果RalB在293T细胞中表达明显降低,在乳腺癌细胞株MCF-7、卵巢癌细胞株HO8910、宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株、结肠癌细胞株LOVO、SW480中均有表达,其中RalB蛋白在结肠癌细胞株SW480中表达明显增高。结论RalB可能以组织特异性的方式在不同肿瘤细胞中表达。 展开更多

关键词 RalB蛋白 肿瘤细胞 WESTERN blot方法

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人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10基因的克隆、原核表达载体的构建及表达

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作者 杜红延 马奎 +2 位作者 黄湘 王穗海 李明 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期698-700,共3页

目的获取泛素偶联酶家族成员之一的UBE2C/UbcH10的基因,构建具有His标签的原核表达载体,在大肠杆菌中表达UBE2C/UbcH10蛋白。方法利用RT-PCR的方法从肝癌细胞HepG2中获得UbcH10的基因,克隆到pMD-19T载体中并测序鉴定,酶切回收后插入原... 目的获取泛素偶联酶家族成员之一的UBE2C/UbcH10的基因,构建具有His标签的原核表达载体,在大肠杆菌中表达UBE2C/UbcH10蛋白。方法利用RT-PCR的方法从肝癌细胞HepG2中获得UbcH10的基因,克隆到pMD-19T载体中并测序鉴定,酶切回收后插入原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体pET32a-UbcH10,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达。结果重组表达载体pET32a-UbcH10在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导4h获得稳定高效的融合表达。重组蛋白以可溶形式存在,大小在29.0kD左右。结论UbcH10重组表达载体的成功构建以及重组蛋白的表达,为进一步其结构和功能的研究奠定了基础,有望揭示该蛋白在癌症发生发展过程中的作用。 展开更多

关键词 泛素偶联酶 原核表达载体 构建 表达

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siRNA介导的新趋化因子VCC-1沉默对人SMMC7721肝癌细胞生长的影响

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作者 牟霞 陈瑶 +1 位作者 王穗海 李明 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期682-685,共4页

目的探讨siRNA靶向抑制VCC-1表达对人肝癌细胞株SMMC7721生长的影响。方法采用脂质体法将siRNA质粒导入SMMC7721细胞,建立VEGF相关的趋化因子1(VCC-1)基因表达沉默的肝癌细胞系,用Western blot检测细胞中VCC-1的表达水平,用MTT法、软琼... 目的探讨siRNA靶向抑制VCC-1表达对人肝癌细胞株SMMC7721生长的影响。方法采用脂质体法将siRNA质粒导入SMMC7721细胞,建立VEGF相关的趋化因子1(VCC-1)基因表达沉默的肝癌细胞系,用Western blot检测细胞中VCC-1的表达水平,用MTT法、软琼脂克隆形成实验等研究siRNA靶向抑制VCC-1表达对SMMC7721细胞生长的影响。结果Western blot结果显示RNA干扰组(shVCC1-1组)细胞VCC-1蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.01),MTT法结果显示shVCC1-1组细胞增殖速度、克隆形成率均低于对照组(P<0.05)。结论 siRNA靶向抑制VCC-1表达可以抑制人SMMC7721肝癌细胞增殖能力及克隆形成能力。 展开更多

关键词 VCC-1 肝癌 SMMC7721细胞 SIRNA

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