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猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用 被引量：1
1
作者 刘大凯 韩郁茹 +8 位作者 张记宇 张燎原 冯廷帅 杨小曼 曾苗苗 时洪艳 秦毅斌 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期499-504,共6页
为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和... 为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 S蛋白 原核表达 多克隆抗体 初步应用
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猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立
2
作者 刘思雨 何颖 +6 位作者 卢冰霞 赵武 赵硕 许心婷 全琛宇 秦毅斌 欧阳康 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1238-1248,共11页
【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白 原核表达 多克隆抗体制备 间接ELISA
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猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3
3
作者 刘磊 何颖 +14 位作者 陈忠伟 赵武 段群棚 赵硕 梁家幸 周英宁 全琛宇 许心婷 陈婷婷 许艺兰 李斌 蒋冬福 卢敬专 秦毅斌 卢冰霞 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第2期67-72,共6页
旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21... 旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组N蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示:重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示:PDCoV N蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 N基因 原核表达 多克隆抗体 抗原性分析
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JEV、PRRSV、PPV及PRV多重PCR检测方法的建立及应用 被引量：2
4
作者 李斌 赵硕 +14 位作者 周英宁 赵武 蒋家霞 何颖 郭旋 卢冰霞 林昌华 秦毅斌 段群棚 全琛宇 许心婷 陈婷婷 许艺兰 陈忠伟 张宁 《动物医学进展》 北大核心 2023年第3期48-53,共6页
为了建立一种能快速鉴别猪日本脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的准确、高效的多重常规PCR检测方法,针对JEV、PRRSV、PPV、PRV基因保守区域合成特异性引物,优化后获得最优反应条件... 为了建立一种能快速鉴别猪日本脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的准确、高效的多重常规PCR检测方法,针对JEV、PRRSV、PPV、PRV基因保守区域合成特异性引物,优化后获得最优反应条件,对该方法特异性、敏感性、重复性进行了测定,并应用该方法对临床样品进行初步应用。结果显示,该方法对JEV、PRRSV、PPV、PRV可进行特异性扩增,对混合阳性质粒检测下限达2×10^(6)copies/μL,对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等相关病毒均无扩增,且重复性良好。用该方法检测51份2021年采集的广西区内组织样品,检出JEV、PRRSV、PPV、PRV阳性率分别为7.84%、50.98%、5.88%、23.53%,且存在多重混合感染的情况。所建立的多重PCR方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,可应用于临床常见猪繁殖障碍性病毒病的快速诊断和监测预警,为猪繁殖障碍性病毒病提供了诊断技术支持。 展开更多
关键词 日本脑炎病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪细小病毒 猪伪狂犬病病毒 多重PCR
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猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
5
作者 周颖 赵硕 +10 位作者 覃国喜 梁龙华 肖婷 陈忠伟 卢冰霞 秦毅斌 林昌华 张胜斌 段群棚 胡庭俊 何颖 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期11-16,共6页
为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感... 为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 TaqMan荧光定量PCR
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猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定
6
作者 张宁 赵平 +12 位作者 刘思雨 赵硕 陈忠伟 何颖 欧阳康 卢冰霞 蒋家霞 郭旋 林昌华 赵武 黄伟坚 秦毅斌 赵凌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期115-125,共11页
为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后... 为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 N蛋白 单克隆抗体
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猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型和3型多重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用 被引量：3
7
作者 肖婷 何颖 +14 位作者 赵硕 蒋家霞 陈忠伟 郭旋 卢冰霞 林昌华 赵武 秦毅斌 段群棚 全琛宇 许心婷 陈婷婷 许艺兰 胡庭俊 张宁 《动物医学进展》 北大核心 2023年第2期8-14,共7页
为建立一种快速、特异的猪肺炎支原体(Mhp)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的多重荧光定量PCR鉴别检测方法,根据Mhp、PCV2和PCV3及β-actin基因保守区域序列,设计合成4对特异性引物及4种荧光基团标记的Taq Man探针。构建含... 为建立一种快速、特异的猪肺炎支原体(Mhp)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的多重荧光定量PCR鉴别检测方法,根据Mhp、PCV2和PCV3及β-actin基因保守区域序列,设计合成4对特异性引物及4种荧光基团标记的Taq Man探针。构建含有各目的基因的重组质粒标准品,筛选引物,优化反应条件,成功建立多重荧光定量PCR后评价该方法的特异性、敏感性、重复性并将该方法初步应用于临床样品检测。结果显示,该方法能同时特异性地鉴别检测Mhp、PCV2和PCV3,检测PRRSV、CSFV、PRV、JEV、PPV、PEDV、TGEV、FMDV病毒核酸无交叉反应;对Mhp、PCV2、PCV3和β-actin标准质粒的最小检出量分别为26.4、66.7、25.6、5990 copies/μL;该方法重复性好,组间和组内试验变异系数低于1.5%;用该方法检测101份临床样本,Mhp、PCV2和PCV3阳性率分别为20.8%、36.6%和33.7%。建立的多重荧光定量PCR方法能同时快速和定量检测Mhp、PCV2和PCV3,较普通PCR更敏感,实用性强,有效避免了多次检测耗时长、费用高的问题,为Mhp、PCV2和PCV3的监测和防控提供了可靠的检测技术。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒3型 多重荧光定量PCR
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克氏原螯虾副溶血性弧菌的分离鉴定与小鼠致病性试验
8
作者 许艺兰 陈婷婷 +13 位作者 卢冰霞 梁家幸 周英宁 黄广杰 江新华 何肈强 许心婷 全琛宇 赵硕 秦毅斌 段群棚 许佳乐 何颖 陈忠伟 《水产学杂志》 CAS 2024年第4期42-48,83,共8页
为探究从广西某养殖基地收集的患病克氏原螯虾(Procambarus clarkii)分离获得的一株细菌GXBL的致病性和生物学特性,利用形态学、分子生物学及生理生化综合鉴定菌株,进行分离菌感染实验动物、组织病理实验及药敏实验。结果显示,分离株GXB... 为探究从广西某养殖基地收集的患病克氏原螯虾(Procambarus clarkii)分离获得的一株细菌GXBL的致病性和生物学特性,利用形态学、分子生物学及生理生化综合鉴定菌株,进行分离菌感染实验动物、组织病理实验及药敏实验。结果显示,分离株GXBL在TCBS培养基上菌落呈蓝绿色、圆形,染色镜检为短棒状或弧状的革兰氏阴性菌;生理生化鉴定结果显示,分离菌能发酵阿拉伯糖、葡萄糖、甘露醇、尿素、精氨酸和甲基红,不能发酵纤维二糖、乳糖及蔗糖;16S rRNA序列分析显示该分离菌为副溶血性弧菌;动物试验结果显示,该分离菌对小鼠有一定的致病性,造成小鼠的肝细胞大片坏死,肝板结构被破坏,肺泡壁显著增厚,血管内聚集大量红细胞,脾脏淋巴细胞明显减少;药敏结果显示,分离菌对氨苄西林、头孢哌酮、庆大霉素、四环素、多黏菌素B、复方新诺明等18种抗生素敏感,对青霉素G、甲硝唑和氟康唑3种药物耐药。本研究结果可为副溶血性弧菌引起的克氏原螯虾细菌性疾病防治提供参考依据。 展开更多
关键词 克氏原螯虾 副溶血性弧菌 分离鉴定 药敏试验 致病性
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广西猪乙型脑炎血清流行病学调查分析 被引量：14
9
作者 秦毅斌 何颖 +10 位作者 何苹萍 李斌 卢冰霞 赵武 梁家幸 苏乾莲 严子斌 李常挺 刘芳 梁保忠 黄伟坚 《南方农业学报》 CAS CSCD 2011年第6期668-671,共4页
【目的】了解广西地区猪乙型脑炎(JE)的感染情况及流行态势,为制定广西猪群JE监测和防控体系提供参考依据。【方法】2008～2010年,采集广西边境14市未经JE疫苗免疫的2597份猪血清,采用LAT检测乙型脑炎病毒(JEV)血清抗体,并对不同区域、... 【目的】了解广西地区猪乙型脑炎(JE)的感染情况及流行态势,为制定广西猪群JE监测和防控体系提供参考依据。【方法】2008～2010年,采集广西边境14市未经JE疫苗免疫的2597份猪血清,采用LAT检测乙型脑炎病毒(JEV)血清抗体,并对不同区域、季节和年龄段等猪群JE流行状况进行分析。【结果】广西受检猪群JEV血清抗体平均阳性率为60.65%;感染率以桂南地区最高(72.15%),桂北地区最低(35.71%);夏秋季节(5～11月)是主要流行季节,平均JEV血清抗体阳性率达70.67%,3～4月仅为26.75%;2008～2010年,猪群JEV血清抗体阳性率总体呈上升趋势。【结论】广西受检猪群JE感染较普遍,有一定的地域性及季节性,且感染率呈逐年上升趋势。猪是JEV重要的贮存宿主及传染源,应采取有效的监测与防控措施,杜绝猪JE的流行传播。 展开更多
关键词 猪乙型脑炎(JE) 血清 流行病学 广西
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猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用 被引量：5
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作者 秦毅斌 卢冰霞 +8 位作者 段群棚 何颖 李斌 梁家幸 苏乾莲 周英宁 蒋冬福 卢敬专 赵武 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第11期2746-2751,共6页
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的... 为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型;通过对退火温度等反应条件的优化,建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR鉴别检测方法。结果显示,所建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株;PEDV变异毒株扩增出2条目的条带,分别为234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段;PEDV经典毒株扩增出1条目的条带,片段大小为234 bp的ORF3基因片段;而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带,片段大小为185 bp的ORF3基因片段;与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl;且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹泻样品进行检测,样品中PEDV阳性样品有64份,其中变异毒株占89.06%(57/64),经典毒株占4.69%(3/64),弱毒疫苗株占6.25%(4/64)。结果表明,该多重RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 变异毒株 经典毒株 弱毒疫苗株 RT-PCR 鉴别诊断
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猪丁型冠状病毒CH/GX/1468B/2017的分离鉴定及全基因组序列分析 被引量：9
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作者 秦毅斌 何苹萍 +12 位作者 卢冰霞 何颖 梁家幸 刘磊 段群棚 韦嫔媛 李斌 陈忠伟 周英宁 苏乾莲 蒋冬福 卢敬专 赵武 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第7期1907-1916,共10页
本研究于广西某猪场采集疑似感染猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的腹泻仔猪小肠及其内容物进行病毒分离,并通过细胞病变(CPE)、RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和全基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定。结果显示,试验成... 本研究于广西某猪场采集疑似感染猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的腹泻仔猪小肠及其内容物进行病毒分离,并通过细胞病变(CPE)、RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和全基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定。结果显示,试验成功分离到1株PDCoV,命名为CH/GX/1468B/2017(简称PDCoV 1468B)。该毒株可稳定有效地在LLC-PK细胞生长增殖,并引起典型CPE;该毒株已在LLC-PK细胞连续传代15代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在108.10TCID50/mL以上。该毒株全基因组序列长25 399 nt;与23个GenBank中登录的参考毒株的全基因组序列比对显示,核苷酸同源性为97.2%~99.4%,其中PDCoV 1468B分离毒株与Vietnam/Binh21/2015株同源性最高,为99.4%。全基因组系统进化分析显示,PDCoV 1468B分离毒株属于Ⅱ群,与东南亚国家PDCoV毒株亲缘关系密切,处于同一进化分支。综上所述,本研究成功分离出PDCoV 1468B株并进行了全基因序列分析,为进一步开展PDCoV致病性等生物学特性研究及疫苗研制奠定了基础,同时可为PDCoV的遗传进化提供数据支持。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒(PDCoV) 分离鉴定 全基因组 序列分析
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猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析 被引量：9
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作者 秦毅斌 卢冰霞 +8 位作者 何颖 段群棚 李斌 陈忠伟 梁家幸 周英宁 苏乾莲 蒋冬福 赵武 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第1期178-188,共11页
本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对... 本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在107.50TCID50/mL。该毒株全基因组序列长28 038bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 分离鉴定 全基因 序列分析
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广西猪戊型肝炎血清流行病学调查 被引量：5
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作者 秦毅斌 赵武 +6 位作者 肖爱欢 梁家幸 梁保忠 何颖 刘芳 李斌 黄伟坚 《广西农业科学》 CAS CSCD 2010年第4期383-385,共3页
为了解广西各地猪群戊型肝炎(HE)的感染状况及其流行特点,采用双抗原夹心ELISA检测来自广西11个市34个猪场及南宁市某屠宰场猪血清中的抗HEV抗体,并比较分析不同地区、不同年龄段猪抗HEV抗体阳性率的差异。结果表明,所检测的34个猪场均... 为了解广西各地猪群戊型肝炎(HE)的感染状况及其流行特点,采用双抗原夹心ELISA检测来自广西11个市34个猪场及南宁市某屠宰场猪血清中的抗HEV抗体,并比较分析不同地区、不同年龄段猪抗HEV抗体阳性率的差异。结果表明,所检测的34个猪场均为抗HEV抗体阳性猪场;537份血清中有448份呈阳性,阳性率为83.4%;其中2月龄以内、3～4月龄和5月龄以上猪的抗体阳性率分别为74.0%、47.0%和95.5%,差异显著(P<0.05);广西各地区猪群抗HEV抗体阳性率均在70.0%以上,差异不显著(P>0.05)。可见,广西猪群普遍存在HEV感染,且母源抗体消失后,猪群抗HEV抗体阳性率随着年龄增长而升高。 展开更多
关键词 猪戊型肝炎 流行病学 双抗原夹心ELISA 广西
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仔猪雷极氏普罗菲登斯菌的分离鉴定及系统进化分析 被引量：2
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作者 秦毅斌 何颖 +11 位作者 卢冰霞 李斌 李莹莹 梁家幸 陈忠伟 梁保忠 苏乾莲 周英宁 蒋冬福 黎珂钰 卢敬专 赵武 《动物医学进展》 北大核心 2015年第3期35-40,共6页
为了解猪雷极氏普罗菲登斯菌（P.rettgeri）的生物学特性、致病性及16SrRNA基因系统进化关系,从发生严重腹泻、血便的哺乳仔猪群的内脏器官中分离到1株病原菌,根据形态特征、培养特性、生化特性、16SrRNA基因序列分析鉴定为P.rettgeri... 为了解猪雷极氏普罗菲登斯菌（P.rettgeri）的生物学特性、致病性及16SrRNA基因系统进化关系,从发生严重腹泻、血便的哺乳仔猪群的内脏器官中分离到1株病原菌,根据形态特征、培养特性、生化特性、16SrRNA基因序列分析鉴定为P.rettgeri。小鼠攻毒试验证实,该分离菌株对试验小鼠有较强致病力,哺乳仔猪回归试验可复制出与临床上相似的典型症状,并从发病死亡小鼠及哺乳仔猪中分离到攻毒菌株。系统进化分析表明,分离菌株与雷极氏普罗菲登斯菌系统进化关系最为密切,其16SrRNA基因序列与雷极氏普罗菲登斯菌代表菌株的同源性在97.3%-99.6%之间。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢唑啉、头孢呋肟、头孢吡肟、阿莫西林、链霉素、氨曲南、诺氟沙星、左氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、氨苄青霉素、米诺环素、链霉素、阿米卡星等多数药物敏感。首次报道了雷极氏普罗菲登斯菌可以引起哺乳仔猪严重腹泻,提示在仔猪腹泻中应注意该菌感染的诊断、监测和防控。 展开更多
关键词 雷极氏普罗菲登斯菌 分离鉴定 16S RRNA 系统进化
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猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用 被引量：2
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作者 秦毅斌 刘磊 +10 位作者 卢冰霞 段群棚 何颖 陈忠伟 周英宁 李斌 赵硕 梁家幸 苏乾莲 蒋冬福 赵武 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期74-82,共9页
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达纯化的PEDV S2重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PEDV重组S2蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,重组蛋白抗原最佳包被量0.8μg/孔;血清最佳... 为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达纯化的PEDV S2重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PEDV重组S2蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,重组蛋白抗原最佳包被量0.8μg/孔;血清最佳稀释倍数为1∶40,最佳血清孵育时间为120 min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶4000,最佳二抗反应时间为45 min;最佳底物显色时间为15 min;待检血清样品S/P值>0.212时判定为阳性,待检血清样品S/P值<0.188时判定为阴性,当0.188≤待检血清样品S/P值≤0.212时判定为可疑。以S2蛋白作为包被抗原建立的PEDV抗体间接ELISA方法仅对PEDV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪丁型冠状病毒等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用本研究建立的PEDV S2蛋白间接ELISA抗体检测方法对广西地区不同阶段猪群血清样品共计622份进行检测,总体样品阳性率为76.05%,不同阶段阳性率相差较大。本实验建立的ELISA方法可应用于临床样品PEDV抗体检测以及PEDV血清流行病学调查。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S2基因 ELISA
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猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用 被引量：1
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作者 秦毅斌 苏乾莲 +8 位作者 赵硕 卢冰霞 何颖 周展宏 袁婷婷 李斌 段群棚 欧阳康 赵武 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第11期37-42,46,共7页
为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为阳性标准品,通过优化反应条件,建立了检测PTV的RT-qPCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果... 为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为阳性标准品,通过优化反应条件,建立了检测PTV的RT-qPCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,该方法仅对PTV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与4.6×10^(8)~4.6×10_(2)拷贝/μL的质粒浓度范围具有良好线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.201×log X+40.527,线性相关系数(R^(2))为0.996,检测下限为4.6×10^(1)拷贝/μL。对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于4.0%,具有良好的重现性。应用所建立的方法对235份临床猪腹泻样品进行检测,PTV阳性样品32份,样品阳性率为13.62%。本试验建立的RT-qPCR方法为PTV实验室检测及病毒研究分析提供了可靠的技术手段。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 荧光定量RT-PCR TAQMAN探针
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仔猪腹泻性大肠杆菌蜂胶灭活菌苗的研制及应用 被引量：2
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作者 秦毅斌 梁家幸 +10 位作者 卢冰霞 何颖 黎珂钰 李斌 苏乾莲 周英宁 蒋冬福 卢敬专 陈忠伟 闭炳芬 赵武 《养猪》 2015年第2期116-118,共3页
为研究猪场大肠杆菌蜂胶灭活菌苗对仔猪大肠杆菌性腹泻的防治作用,对广西某中型养猪场发生哺乳仔猪持续性腹泻病例进行流行病学调查和实验室诊断。从腹泻仔猪的肾脏、肠系膜淋巴结等内脏器官中分离到病原菌,经生理生化、培养特性、形态... 为研究猪场大肠杆菌蜂胶灭活菌苗对仔猪大肠杆菌性腹泻的防治作用,对广西某中型养猪场发生哺乳仔猪持续性腹泻病例进行流行病学调查和实验室诊断。从腹泻仔猪的肾脏、肠系膜淋巴结等内脏器官中分离到病原菌,经生理生化、培养特性、形态特征鉴定为大肠杆菌。药敏试验结果表明,分离菌株对环丙沙星、恩诺沙星、利福平、新生霉素、复方新诺明、奥普托欣、克林霉素、万古霉素等24种药物均耐药,占试验药物的68.57%。以分离菌株为制苗菌株,经培养灭活后,以蜂胶为佐剂,研制出本场大肠杆菌蜂胶灭活菌苗,对产前15 d的妊娠母猪进行免疫,仔猪通过母乳获得母源抗体来预防大肠杆菌性腹泻。临床应用表明,该菌苗使用安全、免疫效果良好,可显著降低哺乳仔猪持续性大肠杆菌性腹泻的发病率,提高哺乳仔猪成活率,降低药物治疗成本及耐药性的产生,是预防仔猪大肠杆菌性腹泻的有效措施。 展开更多
关键词 大肠杆菌 分离鉴定 灭活菌苗
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一起乙型脑炎致猪繁殖障碍病例的确诊 被引量：3
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作者 秦毅斌 赵武 +8 位作者 梁家幸 卢冰霞 李斌 何颖 闭炳芬 苏乾莲 李常挺 梁保忠 黄伟坚 《广西畜牧兽医》 2011年第6期326-328,共3页
2010年8月,广西某规模养猪场出现群发性初产母猪繁殖障碍病例,经PCR/RT-PCR检测,结果在一份木乃伊胎儿中检测到乙脑病毒核酸,而猪细小病毒为阴性。疫苗免疫回顾性调查发现,该批初产母猪漏免了猪乙脑疫苗,从而认为乙脑病毒是引起这起繁... 2010年8月,广西某规模养猪场出现群发性初产母猪繁殖障碍病例,经PCR/RT-PCR检测,结果在一份木乃伊胎儿中检测到乙脑病毒核酸,而猪细小病毒为阴性。疫苗免疫回顾性调查发现,该批初产母猪漏免了猪乙脑疫苗,从而认为乙脑病毒是引起这起繁殖障碍的病原。 展开更多
关键词 猪乙型脑炎 猪细小病毒 繁殖障碍
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近年广西主要猪病的流行概况及防控对策 被引量：1
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作者 秦毅斌 何颖 +5 位作者 卢冰霞 梁保忠 梁家幸 周英宁 李斌 赵武 《广西畜牧兽医》 2013年第6期370-374,共5页
近年，随着我国养猪业的不断发展，养殖规模扩大，技术水平不断提高，生猪生产总体平稳，但猪病对养猪生产的影响和危害依然很大。猪病的种类越来越多，控制也越来越困难。一些疫病，如仔猪流行性腹泻持续发生和流行以及猪繁殖与呼吸综... 近年，随着我国养猪业的不断发展，养殖规模扩大，技术水平不断提高，生猪生产总体平稳，但猪病对养猪生产的影响和危害依然很大。猪病的种类越来越多，控制也越来越困难。一些疫病，如仔猪流行性腹泻持续发生和流行以及猪繁殖与呼吸综合征（俗称“猪蓝耳病”）的散发性疫情等均给养猪业造成极大的经济损失。 展开更多
关键词 防控对策 流行概况 猪病 猪繁殖与呼吸综合征 广西 猪流行性腹泻 养殖规模 生猪生产
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广西猪群新发感染猪捷申病的检测诊断
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作者 秦毅斌 苏乾莲 +10 位作者 赵硕 梁家幸 李斌 卢冰霞 周展宏 陈忠伟 何颖 段群棚 周英宁 蒋冬福 赵武 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第11期2699-2703,共5页
【目的】建立猪捷申病毒(PTV)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的检测方法,并应用于广西猪群PTV感染诊断。【方法】通过对GenBank中登录的PTV不同血清型基因序列,在5’端保守区设计一对特异性引物,经退火温度摸索及特异性和敏感性试验,建立... 【目的】建立猪捷申病毒(PTV)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的检测方法,并应用于广西猪群PTV感染诊断。【方法】通过对GenBank中登录的PTV不同血清型基因序列,在5’端保守区设计一对特异性引物,经退火温度摸索及特异性和敏感性试验,建立PTV的RT-PCR检测方法,并对广西部分猪场腹泻病例进行猪捷申病的感染诊断。【结果】所建立的方法能特异性地扩增PTV,不能扩增猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒、猪丁型冠状病毒。建立的方法具有较高的敏感性,可检测低至1.16 pg/μl的质粒模板及12.15 pg/μl的核酸模板。应用建立的RT-PCR方法对2018年3月-2019年4月从广西部分猪场采集的235份病猪腹泻粪便进行PTV临床检测,PTV阳性为24份,阳性率为10.21%。【结论】建立的PTV RT-PCR方法简单特异、灵敏度高,可适用于实验室PTV检测诊断。广西部分受检猪场已存在PTV感染,应予以警惕,加强监测与防控。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 诊断 临床检测
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