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PRRSV BZ4-19株的分离鉴定及其全基因序列分析
1
作者 李思琪 刘莹 +5 位作者 刘濮毓 任晓祥 李岩岩 王文钊 左玉柱 范京惠 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期200-207,共8页
为了解山东滨州某猪场PRRSV的流行及变异情况,将该猪场采集的疑似PRRSV阳性病料进行RT-PCR检测,检测出的阳性样品用Marc-145细胞进行分离,设计了9对扩增引物用于分离株(BZ4-19)的全基因扩增,将扩增出的全基因序列进行核苷酸及其推导的... 为了解山东滨州某猪场PRRSV的流行及变异情况,将该猪场采集的疑似PRRSV阳性病料进行RT-PCR检测,检测出的阳性样品用Marc-145细胞进行分离,设计了9对扩增引物用于分离株(BZ4-19)的全基因扩增,将扩增出的全基因序列进行核苷酸及其推导的氨基酸序列分析。最终成功在Marc-145细胞上分离到1株RespPRRS MLV-like毒株,全基因扩增结果显示其全长为15412 bp(不含polyA尾);核苷酸同源性分析说明,其与美洲经典株VR2332及RespPRRS MLV(疫苗株)同源性最高,分别为99.4%和99.8%。将BZ4-19分离株与VR2332、RespPRRS MLV的氨基酸序列进行比较分析揭示,VR2332与RespPRRS MLV共有30处氨基酸差异,在这30处差异中,分离株与VR2332有7处一致,与RespPRRS MLV有23处一致。在鉴别VR2332与RespPRRS MLV的9处可能与毒力相关的氨基酸位点时,分离株有7处与VR2332相同,由此推测本研究分离到的毒株属于疫苗株RespPRRS MLV返强毒株,我国具有上述分子变化的PRRSV的流行应被关注。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV) 经典美洲株 RespPRRS MLV株 病毒分离鉴定 流行病学
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表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究
2
作者 李岩岩 张帅 +5 位作者 赵云环 任晓祥 李思琪 王文钊 左玉柱 范京惠 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期70-77,共8页
为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(a... 为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829~aa837)的融合基因(PCV2-Cap^(169~180)-E2^(829~837))经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化得到单一的目的蛋白;western blot结果显示,重组蛋白能够与猪源PCV2多克隆抗体(PAb)、猪源CSFV PAb及HRP标记的6×His-Tag小鼠单克隆抗体(MAb)发生特异性反应,在49 ku处出现特异性条带;电镜观察可见重组蛋白形成规则的VLP;抗体的ELISA结果显示,与PBS对照相比,VLP能够诱导小鼠产生较高的PCV2及CSFV抗体水平(P<0.01),与各商品化疫苗均无显著差异。细胞因子的ELISA结果显示,与PBS对照组相比,VLP能够诱导小鼠产生较高水平的细胞因子(P<0.01)。体外病毒中和试验结果显示,VLP免疫的小鼠血清中具有中和PCV2的活性。综上所述,本实验首次在大肠杆菌中可溶性表达并获得了纯化的重组蛋白(PCV2-Cap-E2),且其能够在体外自组装成VLP,并可刺激小鼠产生针对PCV2 Cap蛋白及CSFV E2蛋白的特异性抗体,为研制针对PCV2和CSFV的新型二联VLP疫苗提供了物质基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 病毒样颗粒 猪瘟病毒E2蛋白 CAP蛋白
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表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化
3
作者 郭禹 程晶 +2 位作者 左玉柱 范京惠 姜海军 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2091-2100,共10页
【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protei... 【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。 展开更多
关键词 C型禽偏肺病毒 迷你基因组 反向遗传系统 CMV启动子 增强绿色荧光蛋白 T7启动子
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牛冠状病毒河北流行株部分基因全序列测定及分子特征分析 被引量：1
4
作者 刘莹 顾文源 +5 位作者 刘媛 曹立辉 彭志豪 王梦佳 左玉柱 范京惠 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期191-202,共12页
牛冠状病毒(BCoV)是引起新生犊牛腹泻的重要病原之一,在世界范围内广泛分布,严重影响养牛业的健康发展。为确定河北省BCoV流行毒株的基因遗传进化特征,本研究对从河北省某牛场腹泻犊牛的粪便和肠内容物中鉴定出的1株BCoV流行毒株(BCoV/C... 牛冠状病毒(BCoV)是引起新生犊牛腹泻的重要病原之一,在世界范围内广泛分布,严重影响养牛业的健康发展。为确定河北省BCoV流行毒株的基因遗传进化特征,本研究对从河北省某牛场腹泻犊牛的粪便和肠内容物中鉴定出的1株BCoV流行毒株(BCoV/CH/HB-BD/2019),进行了S、N、HE基因的全序列扩增及测定,并与GenBank中的51株牛冠状病毒参考株进行了各基因的同源性和遗传进化分析。结果显示:BCoV/CH/HB-BD/2019与BCoV参考株相比,S基因具有2个独特的氨基酸变异位点(N311S、D1276Y);在HE基因中HB-BD株出现2个独特的氨基酸变异位点,分别为G400V、D423H;虽然在基因的重组分析中,HB-BD株HE基因序列并没有检测到基因重组信号,但通过检测我们发现,HB-BD株HE基因序列为其新疆毒株(KU886219.1)推测的主要亲本毒株;进化分析发现,BCoV HB-BD株与人冠状病毒(HCoV-OC43)均属于β类冠状病毒属2a亚群,且同源性高达96.0%,而正在全世界范围内传播的SARS-CoV-2属于β类冠状病毒属2b亚群病毒,BCoV与SARS-CoV-2属于同一冠状病毒属不同亚群。本研究为牛冠状病毒病的防控以及进一步揭示冠状病毒之间的关系提供了依据。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 S基因 N基因 HE基因 序列扩增 序列分析
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规模化猪场生物安全措施调查与分析 被引量：2
5
作者 张帅 王俞丹 +2 位作者 郑丽丽 范京惠 左玉柱 《猪业科学》 2023年第3期90-92,共3页
1引言近年来,我国生猪养殖模式发生了巨大变化,由农户散养模式正逐步向规模化养殖模式转变,养殖模式的转变给养殖场带来经济利益的同时,也带来了巨大的生物安全隐患。生物安全是近年来提出的有关集约化生产过程中保护和提高畜禽健康的... 1引言近年来,我国生猪养殖模式发生了巨大变化,由农户散养模式正逐步向规模化养殖模式转变,养殖模式的转变给养殖场带来经济利益的同时,也带来了巨大的生物安全隐患。生物安全是近年来提出的有关集约化生产过程中保护和提高畜禽健康的系统化管理实践,是预防病原体和传染因子进入猪群生产的每一阶段采取的规定与措施。陆续发生的非洲猪瘟疫情凸显了生猪养殖过程中生物安全风险管理的重要性和必要性,尤其是在目前非洲猪瘟无苗可防、无药可治的大环境下。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 生物安全措施 畜禽健康 传染因子 规模化猪场 规模化养殖 生猪养殖 农户散养
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2022年~2023年上半年河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析
6
作者 顾文源 张帅 +4 位作者 赵云环 李思琪 刘濮毓 范京惠 左玉柱 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期1287-1294,共8页
为了解当前河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及流行株的遗传变异情况,本研究利用荧光定量PCR方法对2022年~2023年上半年于河北省不同规模养猪场采集的229份疑似PRRSV感染猪的组织病料样品进行检测,结果显示,PRRSV阳性率为17.9... 为了解当前河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及流行株的遗传变异情况,本研究利用荧光定量PCR方法对2022年~2023年上半年于河北省不同规模养猪场采集的229份疑似PRRSV感染猪的组织病料样品进行检测,结果显示,PRRSV阳性率为17.9%(41/229)。对鉴定的15株PRRSV ORF5基因进行测序、遗传进化分析、以及潜在的N-糖基化位点分析。结果显示,15株PRRSV ORF5基因序列的同源性为81.8%~99.8%,氨基酸序列的同源性为81.1%~100.0%;15株PRRSV均属于PRRSV-2型,其中的10株属于谱系1(Lineage 1),1株属于Lineage 5,4株属于Lineage 8;属于Lineage 5的HB-HD-2株为一株类RespPRRS MLV疫苗株。部分病毒株的GP5蛋白氨基酸序列毒力相关位点出现R13Q、R151I、R151K突变,属于Lineage 1的10株PRRSV GP5蛋白在诱骗表位出现V27A和V29A突变,在其它中和表位区及高变区也出现了不同程度的变异;糖基化位点分析结果显示,GP5蛋白在aa44~aa46、aa51~aa53位N-糖基化位点相对保守,在aa30~aa32、aa33~aa35、aa34~aa36和aa57~aa59发生了不同程度的突变。以上结果表明,当前河北省PRRSV流行株复杂多样,Lineage 1 PRRSV(NADC30-Like、NADC34-Like)正成为优势病毒株,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防控形势仍较为严峻。本研究为掌握当前河北省PRRSV的遗传变异情况,以及PRRS疫苗开发和防控提供了新数据和信息。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 遗传进化分析 N-糖基化位点 GP5蛋白
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猪场常见消毒药对非洲猪瘟病毒的消毒效果
7
作者 顾文源 张帅 +3 位作者 贾丽娜 赵云环 范京惠 左玉柱 《中国动物检疫》 CAS 2023年第8期103-108,共6页
为做好非洲猪瘟(ASF)防控,保障猪场生物安全措施的有效实施,通过查阅文献分析了多种猪场常见消毒药(火碱、酸、过硫酸氢钾、卤素类和醛类)的特点及使用方法,综述了其对非洲猪瘟病毒(ASFV)的杀灭效果。结果显示:在22℃时,1.0%和0.5%的火... 为做好非洲猪瘟(ASF)防控,保障猪场生物安全措施的有效实施,通过查阅文献分析了多种猪场常见消毒药(火碱、酸、过硫酸氢钾、卤素类和醛类)的特点及使用方法,综述了其对非洲猪瘟病毒(ASFV)的杀灭效果。结果显示:在22℃时,1.0%和0.5%的火碱溶液可将ASFV杀灭;800倍稀释的二氯异氰尿酸钠溶液可在0.5 h杀灭ASFV;1.0%的柠檬酸能够将ASFV减少4个对数单位以上;3.0%的醋酸以及0.1%、0.5%和1.0%的戊二醛溶液均对ASFV有杀灭效果。综上,推荐火碱(0.5%)或二氯异氰尿酸钠(稀释度1:800)用于环境消毒,戊二醛(0.1%~1.0%)用于带猪消毒。本文通过综述猪场常用消毒药对ASFV的消杀效果,为猪场消毒药的选择和使用提供指导,以助于猪场的ASF防控。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 生物安全 消毒药 效果
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中药组方对PRRS防控效果的评价
8
作者 张帅 代飞 +5 位作者 王敬友 赵云环 王荣申 宫新城 范京惠 左玉柱 《猪业科学》 2023年第11期91-94,共4页
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一种烈性传染病,俗称“猪蓝耳病”,临床以引起母猪的繁... 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一种烈性传染病,俗称“猪蓝耳病”,临床以引起母猪的繁殖障碍以及不同年龄段猪只呼吸道疾病为主要特征。PRRS为免疫抑制性疾病,感染猪免疫系统受损、免疫力下降,易继发其他病原体感染,使得临床症状加重。目前我国流行的PRRSV毒株主要是NADC-30 like、NADC-34 like等类高致病性毒株。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 呼吸道疾病 烈性传染病 繁殖障碍 中药组方 免疫抑制性疾病 猪蓝耳病 病原体感染
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猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析 被引量：1
9
作者 翟刚 顾文源 +4 位作者 刘涛 刘莹 张帅 范京惠 左玉柱 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期847-854,共8页
旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件... 旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示:该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及传染型胃肠炎病毒(TGEV)等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×101拷贝·μL^(-1),比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%~99.1%;氨基酸的相似性为94.6%~98.7%。结果表明:本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 qPCR S基因 遗传变异分析
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猪嵴病毒VP0基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
10
作者 韩磊 彭志豪 +5 位作者 刘莹 顾文源 王丙雷 郭禹 左玉柱 范京惠 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期72-77,共6页
本研究旨在建立一种检测猪嵴病毒(PKV)抗体的间接ELISA检测方法。通过原核表达系统表达PKV VP0基因作为包被抗原,并通过Western blot鉴定证明重组蛋白与PKV阳性血清能发生良好的特异性反应。优化反应条件,得出PKV VP0间接ELISA检测方法... 本研究旨在建立一种检测猪嵴病毒(PKV)抗体的间接ELISA检测方法。通过原核表达系统表达PKV VP0基因作为包被抗原,并通过Western blot鉴定证明重组蛋白与PKV阳性血清能发生良好的特异性反应。优化反应条件,得出PKV VP0间接ELISA检测方法最适反应条件是抗原包被浓度为0.62μg/mL,血清稀释浓度为1∶200,最佳酶标二抗稀释浓度1∶5000,使用5%脱脂奶粉作为封闭液37℃孵育1 h,显色10 min,当检测样品OD_(450)<0.225判定血清样品抗体为阴性,OD_(450)≥0.225判定血清样品抗体为阳性,且特异性高、重复性好,与Western blot符合率达到95.6%。PKV VP0蛋白间接ELISA方法的建立,作为一种操作简单,灵敏度高,特异性高,重复性好的血清学检测方法,为PKV的监测和预防提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪嵴病毒 VP0基因 原核表达 间接ELISA检测
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携带BCoV抗原表位的乙型肝炎病毒核心抗原病毒样颗粒的制备及免疫效果评价
11
作者 郭晓旭 张帅 +5 位作者 刘莹 赵云环 王传文 李妍 范京惠 左玉柱 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期178-184,共7页
为了制备可用于牛冠状病毒(BCoV)亚单位疫苗的含BCoV S蛋白抗原表位的病毒样颗粒(VLP),本研究将BCoV S1和S2蛋白中含B细胞表位的aa351~aa403(159 bp)和aa771~aa784(42 bp)对应的密码子按大肠杆菌偏好性原则优化后插入乙型肝炎病毒核心抗... 为了制备可用于牛冠状病毒(BCoV)亚单位疫苗的含BCoV S蛋白抗原表位的病毒样颗粒(VLP),本研究将BCoV S1和S2蛋白中含B细胞表位的aa351~aa403(159 bp)和aa771~aa784(42 bp)对应的密码子按大肠杆菌偏好性原则优化后插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)主要免疫显性区域(MIR),合成该重组基因后克隆至pET-32a(+),经酶切鉴定显示正确构建了重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-BCoV S1+S2。将该重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和伴侣感受态细胞BL21(DE3)(含pG-KJE8分子伴侣质粒),经诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化两种不同表达形式的重组蛋白,SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及纯化效果,结果显示两种表达系统均正确表达了重组蛋白,分别命名为VLP-A、VLP-B,前者为包涵体表达,后者为可溶性表达。纯化后浓度分别为0.9 mg/mL、1.4 mg/mL。利用透射电镜观察纯化后的两种重组蛋白是否形成VLP,结果显示二者均形成VLP,且可溶性表达的重组蛋白形成的VLP产量略高。将两种VLP乳化后以50μg/只分别免疫小鼠,于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d采血制备血清,采用ELISA方法检测小鼠血清中的BCoV IgG特异性抗体水平及细胞因子IFN-γ、IL-4,结果显示,将两种VLP乳化后免疫小鼠产生的BCoV IgG抗体(P<0.01)和两种细胞因子水平(P<0.05)均显著高于对照组,且可溶性表达的VLP诱导产生的抗体水平和细胞因子水平更高。本研究首次制备了含BCoV S蛋白抗原表位的VLP,两种不同表达形式的重组蛋白均形成VLP,且在小鼠体内均能够产生免疫应答,为BCoV亚单位疫苗及相关生物制品的制备奠定了基础。 展开更多
关键词 乙肝病毒核心抗原 牛冠状病毒 病毒样颗粒 分子伴侣质粒
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A型塞内卡病毒VP2蛋白抗原区的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
12
作者 翟刚 顾文源 +6 位作者 王晶 刘莹 赵云环 刘涛 张帅 左玉柱 范京惠 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1025-1031,共7页
为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化... 为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在42 ku处出现特异性条带,表明r VP2可以与SVA阳性血清特异性反应。以r VP2为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于SVA VP2抗原区的间接ELISA抗体检测方法。本研究建立的间接ELISA检测方法的最适抗原包被浓度为2μg/mL,5%脱脂乳的PBST作为封闭液37℃孵育1 h,待检血清的最适稀释度为1∶500,兔抗猪Ig G-HRP稀释度为1∶10000,最佳显色时间为10 min。当检测样品的S/P值<0.201时,样品检测结果为阴性;当检测样品的S/P值≥0.201时,结果为阳性。利用该方法检测SVA,猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清,结果显示,除SVA检测为阳性外,其他病毒均为阴性,特异性较强。将SVA阳性血清2倍倍比稀释(1∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600)后经该间接ELISA方法检测,评估其敏感性,结果显示,SVA阳性小鼠血清在1∶800稀释后检测结果仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r VP2包被ELISA板,按照该ELISA方法检测8份猪SVA阳性血清,评估该方法的重复性。结果显示,批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,该方法重复性好。利用本实验建立的间接ELISA方法与血清中和试验同时对266份临床血清样品检测,结果显示,本研究建立方法检测的样品阳性率为19.1%,中和试验检测的样品阳性率为19.55%,两种方法检测结果符合率为97.7%。本研究首次基于SVA r VP2建立的间接ELISA方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好,为SVA的检测和其感染的防控提供了可靠的技术支持。 展开更多
关键词 猪 A型塞内卡病毒 VP2 间接ELISA
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猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的截短表达及胶体金免疫层析法的建立
13
作者 胡冉冉 赵云环 +4 位作者 刘莹 张帅 郭禹 左玉柱 范京惠 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第6期94-100,共7页
为建立一种快速、便捷的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的胶体金免疫层析方法,本试验通过原核表达截短的M基因作为检测线,葡萄球菌A蛋白(SPA)和鸡抗SPA作为金标抗原和质控线。结果显示,该试纸条与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性... 为建立一种快速、便捷的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的胶体金免疫层析方法,本试验通过原核表达截短的M基因作为检测线,葡萄球菌A蛋白(SPA)和鸡抗SPA作为金标抗原和质控线。结果显示,该试纸条与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒2型(PCV2),均不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1∶6400,灵敏性高;批间、批内无差异性;4℃可保存30 d,稳定性好;临床样品检测结果与爱德士试剂盒符合率达到94.82%。综上所述,本试验建立了一种敏感性高、特异性好的PRRSV抗体检测的免疫层析试纸条,为PRRSV的监测、预防及诊断提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 M基因 原核表达 胶体金免疫层析法
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戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对3种病原的消毒试验
14
作者 刘濮毓 王文钊 +6 位作者 张帅 李思琪 刘莹 赵云环 王荣申 范京惠 左玉柱 《中国动物检疫》 CAS 2023年第5期115-120,共6页
为探究戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌、猪大肠杆菌的临床消毒效果,以实验室条件模拟临床中戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式,将戊二醛癸甲溴铵和悬浮增效剂以弥雾形式喷雾到所消毒的空间内,对涂布了PRRS... 为探究戊二醛癸甲溴铵弥雾方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌、猪大肠杆菌的临床消毒效果,以实验室条件模拟临床中戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式,将戊二醛癸甲溴铵和悬浮增效剂以弥雾形式喷雾到所消毒的空间内,对涂布了PRRSV的培养皿和接种猪链球菌、猪大肠杆菌的血清培养基进行消毒,消毒后将培养皿内病毒洗脱后接种于Marc-145细胞,血清培养基放置在适宜环境培养,观察细胞病变和细菌生长情况,以此判断消毒效果。结果显示:戊二醛癸甲溴铵在空间浓度为2.1 mL/m^(3),消毒时间为30 min时,对PRRSV有一定的消毒作用;当空间浓度为3.5 mL/m^(3),消毒时间为60 min时,可对PRRSV完全灭活;空间浓度为2.1 mL/m^(3),消毒时间为50 min时,对猪链球菌可完全灭活,消毒时间为35 min时,对大肠杆菌可完全灭活。结果表明,戊二醛癸甲溴铵弥雾消毒方式对PRRSV、猪链球菌和猪大肠杆菌有着良好的消毒效果,可应用于猪场日常空舍消毒,对猪场生物安全防控具有重要意义。 展开更多
关键词 戊二醛癸甲溴铵 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪链球菌 猪大肠杆菌
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枣粉饲料的营养价值及其在动物生产中的应用
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作者 闫金玲 王明亚 +5 位作者 范京惠 张秀江 李树静 肖阳 李秋凤 曹玉凤 《饲料研究》 CAS 北大核心 2023年第10期139-143,共5页
红枣口味甘甜,营养价值丰富,可作为非常规饲料在动物生产中应用。但是红枣鲜果的含水量较高,需要进行一定处理才可作为饲粮使用。制作成枣粉饲料是提高红枣利用效果的方式之一。文章主要综述了我国红枣资源现状、红枣的营养成分、枣粉... 红枣口味甘甜,营养价值丰富,可作为非常规饲料在动物生产中应用。但是红枣鲜果的含水量较高,需要进行一定处理才可作为饲粮使用。制作成枣粉饲料是提高红枣利用效果的方式之一。文章主要综述了我国红枣资源现状、红枣的营养成分、枣粉饲料的种类及其在动物生产中的应用和问题,为枣粉作为非常规饲料在动物生产中的应用提供参考。 展开更多
关键词 枣粉 发酵枣粉 单胃动物 反刍动物 生产性能
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猪流行性腹泻病毒中国地方流行株LJB/03M基因的克隆与序列分析 被引量：38
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作者 范京惠 郎景华 +2 位作者 吴凌 张海峰 李一经 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2005年第7期7-9,共3页
从黑龙江某猪场疑似猪流行性腹泻猪的粪便中提取总RNA,采用RT-RCR方法扩增,首次获得中国地方流行株PEDVM全基因序列,将其克隆到pMD18-T载体中进行测序,克隆的M基因核苷酸序列由681个核苷酸组成,含有一个完整的开放阅读框架,编码226个氨... 从黑龙江某猪场疑似猪流行性腹泻猪的粪便中提取总RNA,采用RT-RCR方法扩增,首次获得中国地方流行株PEDVM全基因序列,将其克隆到pMD18-T载体中进行测序,克隆的M基因核苷酸序列由681个核苷酸组成,含有一个完整的开放阅读框架,编码226个氨基酸。与国外已发表的其他毒株进行基因进化分析,GenBank中的6株PEDV形成的基因进化树具有3个分支。其中分离株LJB/03形成一个独立的分支,说明LJB/03的M基因序列与其他毒株相比,发生了一定的变异。 展开更多
关键词 流行性腹泻病毒 M基因 克隆 序列测定
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猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达 被引量：6
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作者 范京惠 左玉柱 +2 位作者 王玉玲 张炳丽 李一经 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期661-665,共5页
将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果... 将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。 展开更多
关键词 细小病毒样颗粒 猪瘟病毒 猪细小病毒 T细胞表位 VP2基因 表达
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细胞凋亡的研究进展 被引量：17
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作者 范京惠 左玉柱 李一经 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2005年第6期804-807,共4页
细胞凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一。由于细胞凋亡与抗肿瘤、抗衰老等密切相关,因此在生物学和医学方面占有重要地位,对其研究已进入分子水平。文章主要综述了近年来细胞凋亡的研究方法、相关基因及其应用方面的进展。
关键词 细胞凋亡 研究方法 相关基因 应用
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猪流行性腹泻病毒的基因结构及其诊断技术 被引量：6
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作者 范京惠 左玉柱 任晓峰 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2013年第1期54-59,共6页
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PED virus,PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病,以呕吐、水样腹泻和脱水为特征,在亚洲地区尤其是我国养猪场的感染非常严重.猪流行性腹泻的流行病学特征、临床... 猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PED virus,PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病,以呕吐、水样腹泻和脱水为特征,在亚洲地区尤其是我国养猪场的感染非常严重.猪流行性腹泻的流行病学特征、临床症状以及病理变化与猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine,TGE)非常相似,确诊需要借助实验室检测.近年来,随着分子生物学技术的发展和人们对PEDV基因结构及功能认识的深入,PED的诊断技术也取得了很大进展.本文主要对PEDV的基因结构、功能以及诊断技术方面取得的新进展进行综述,以期为PEDV基因的深入研究以及建立特异、快速、简便的诊断方法提供新的思路. 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 基因结构 诊断方法
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鸭源大肠杆菌O_(88)的分离鉴定及药敏试验 被引量：2
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作者 范京惠 左玉柱 +1 位作者 张小波 范慧霞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期93-96,共4页
为了分离鸭大肠杆菌病病原,并筛选出敏感药物,从河北省安新县某大型鸭场30日龄病死雏鸭肝脏分离到一株革兰氏阴性杆菌,通过菌落形态观察、培养特性试验和生化试验鉴定以及药敏试验。确定为大肠杆菌。应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为O... 为了分离鸭大肠杆菌病病原,并筛选出敏感药物,从河北省安新县某大型鸭场30日龄病死雏鸭肝脏分离到一株革兰氏阴性杆菌,通过菌落形态观察、培养特性试验和生化试验鉴定以及药敏试验。确定为大肠杆菌。应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为O_(88)。动物试验结果显示,该分离菌株对小鼠有较强的致死性,为致病性大肠杆菌。药敏试验结果显示,分离菌株对庆大霉素、头孢曲松、头孢拉啶、呋喃妥因等药物敏感,对氨苄西林和链霉素等产生耐药。 展开更多
关键词 鸭 大肠杆菌 分离鉴定 血清型
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