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正常屠宰猪致病性猪链球菌7型的鉴定和特性研究 被引量：1
1
作者 茅爱华 倪艳秀 +9 位作者 吕立新 俞正玉 周俊明 胡东波 温立斌 张雪寒 郭容利 李彬 王小敏 何孔旺 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第5期263-266,共4页
从江苏某地正常屠宰猪扁桃体分离到1株细菌,命名为HA100111。该细菌呈链球菌的特征形态,药敏试验表明该菌株对多种抗生素有耐药性。经PCR及序列分析,确定该分离菌株为猪链球菌7型,其毒力因子基因型为gdh+/m rp-/epf-/sly-/orf2+/fbps+... 从江苏某地正常屠宰猪扁桃体分离到1株细菌,命名为HA100111。该细菌呈链球菌的特征形态,药敏试验表明该菌株对多种抗生素有耐药性。经PCR及序列分析,确定该分离菌株为猪链球菌7型,其毒力因子基因型为gdh+/m rp-/epf-/sly-/orf2+/fbps+。动物致病性试验表明,该菌对ICR小鼠和新西兰兔有较强的致病性,对ICR小鼠半数致死量为2.67×107CFU,但是对仔猪无明显致病作用。得出结论,在正常猪扁桃体中可携带致病性的猪链球菌7型。 展开更多
关键词 正常屠宰猪 猪链球菌7型 鉴定 特性
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重组外源基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒的构建与鉴定 被引量：21
2
作者 潘群兴 何孔旺 +3 位作者 王永山 温立斌 茅爱华 郭容利 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1245-1250,共6页
将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽基因嵌合在猪细小病毒(PPV)VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒(rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap)。IFA和Western blotting分析分别可见特异性荧... 将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽基因嵌合在猪细小病毒(PPV)VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒(rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap)。IFA和Western blotting分析分别可见特异性荧光和大小约为64 ku的特异性带,表明rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap在HEK-293细胞中成功地表达了PPV∶VP2和PCV2∶Cap蛋白。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合PPV∶VP2-PCV2∶Cap蛋白具有与PPV全病毒类似的血凝活性。电镜观察嵌合PPV∶VP2-PCV∶Cap蛋白的粗提物,发现可自行装配成许多病毒样粒子[PPV∶VLP(PCV2)]。 展开更多
关键词 猪细小病毒 猪圆环病毒2型 嵌合 病毒样颗粒
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PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR检测方法的建立及其应用 被引量：18
3
作者 郭容利 何孔旺 +5 位作者 倪艳秀 茅爱华 温立斌 李彬 王小敏 俞正玉 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期1065-1069,共5页
建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)的三重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、5... 建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)的三重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、544 bp(TGEV)、275 bp(PARV)特异性片段,而其他病毒无特异性条带。应用该方法对江苏省及周边地区154份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测,结果表明:PEDV、TGEV、PARV阳性率分别为53.2%、8.4%、5.2%。PEDV与TGEV混合感染率为5.2%,PEDV与PARV混合感染率为4.5%。该方法的建立对临床上进行这3种疾病混合感染的检测具有重要意义。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪A群猪轮状病毒 多重RT-PCR
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猪博卡病毒NP1基因的克隆与原核表达 被引量：17
4
作者 李彬 毛立 +9 位作者 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 马俊杰 周俊明 吕立新 俞正玉 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期28-31,共4页
猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴... 猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 猪博卡病毒 NP1基因 克隆 原核表达
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江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)分子流行病学调查 被引量：28
5
作者 曹东阳 王小敏 +2 位作者 钱爱东 何孔旺 茅爱华 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第2期390-398,共9页
为了解中国江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型（ PCV2）的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况，本研究运用PCR技术对来源于不同地区、不同猪场且PCV2检测为阳性的样品进行全基因组序列的扩增和测序，共获得18株PCV2全基因序列，并对所得... 为了解中国江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型（ PCV2）的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况，本研究运用PCR技术对来源于不同地区、不同猪场且PCV2检测为阳性的样品进行全基因组序列的扩增和测序，共获得18株PCV2全基因序列，并对所得到的毒株进行遗传变异分析。结果表明，18株毒株与国内外的参考毒株同源性为93．5％～99？7％，而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为87．1％～99？9％和84．2％～99？6％，说明毒株存在一定程度的变异。系统进化树分析结果显示18株毒株中有5株PCV2a，7株PCV2b，6株PCV2d，其中20150429YC全长为1766 bp，与（HM038031．1 PCV2d等）参考毒株的同源性为100？0％，未发现PCV2c。同时，Cap蛋白的抗原表位和抗原性也发生了变化。说明，目前江苏省及周边地区猪群中PCV2感染较为普遍，PCV2的流行毒株以PCV2b基因型为主，PCV2d次之。 展开更多
关键词 猪圆环病毒Ⅱ型 分子流行病学 遗传变异
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2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析 被引量：11
6
作者 王小敏 何孔旺 +10 位作者 张文文 陈蔚 茅爱华 俞正玉 温立斌 倪艳秀 张雪寒 吕立新 郭容利 周俊明 李彬 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第18期3886-3894,共9页
【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方... 【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方法】利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。【结果】260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品,阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明,本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型,与GenBank中高致病性PRRSV(HP-PRRSV)参考毒株的氨基酸同源性为94.6%-100%,并可分为5个亚群,亚群III与HP-PRRSV同源性最高,几乎所有的亚群中和表位(primary neutralizing epitope,PNE)都存在变异,亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008-2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省,进化树分析结果表明,病毒的分型并没有呈现明显的地域性。【结论】2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染,PRRSV流行株为HP-PRRSV,其遗传演化相对稳定,但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,虽然亚群IV和V只出现在部分省市,但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 华东地区 ORF5基因 遗传变异
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规模猪场不同日龄仔猪O型口蹄疫母源抗体消长规律及免疫试验 被引量：11
7
作者 吕立新 何孔旺 +2 位作者 倪艳秀 俞正玉 茅爱华 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第5期304-306,共3页
为确定仔猪口蹄疫疫苗首次免疫时间，以规模化养猪场经猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后母猪所生产的仔猪为研究对象，利用液相阻断ELISA诊断试剂盒对仔猪母源抗体消长情况进行检测。结果表明，10、20、30、40日龄仔猪99％以上被保护的分别占... 为确定仔猪口蹄疫疫苗首次免疫时间，以规模化养猪场经猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后母猪所生产的仔猪为研究对象，利用液相阻断ELISA诊断试剂盒对仔猪母源抗体消长情况进行检测。结果表明，10、20、30、40日龄仔猪99％以上被保护的分别占该日龄组的60％、80％、80％、50％，50、60、70、80日龄仔猪99％以上被保护的分别占该日龄组的40％、0、0、0，60％以上仔猪未被充分保护。随着日龄的增加，抗体效价明显下降。对检测猪O型口蹄疫抗体小于1：45的45日龄仔猪10头进行猪O型口蹄疫免疫试验，结果O型日蹄疫一免后14d抗体效价≥27的有10份，达到100％保护。因此，对规模化猪场的仔猪进行口蹄疫疫苗的最佳首免时间为45—50日龄。 展开更多
关键词 仔猪 口蹄疫 母源抗体 效价 消长规律
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中国猪群存在Torque teno Virus(TTV)感染 被引量：9
8
作者 温立斌 何孔旺 +11 位作者 杨汉春 郭容利 李成仁 钟书霖 茅爱华 倪艳秀 张雪寒 周俊明 吕立新 俞正玉 李彬 王小敏 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期85-90,共6页
为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型，基于TTV1和TTV2相对保守的5’非翻译区（5’UTR）设计引物，采用PCR法对2008～2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明，中国猪群，TTV1的感染率为15．9％，... 为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型，基于TTV1和TTV2相对保守的5’非翻译区（5’UTR）设计引物，采用PCR法对2008～2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明，中国猪群，TTV1的感染率为15．9％，TTV2的为34．8％，共感染率为5．8％。所扩增片断的核苷酸序列分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株之间的核苷酸同源性分别为87．3％～93．8％和74．8％～99．1％，与GenBank其他TTV1和TTV2毒株的同源性分别为69．6％～100．0％和74．8％～99．1％。系统进化分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株存在新的基因亚型。 展开更多
关键词 TTV1 TTV2 5’UTR 猪 中国
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出血性大肠杆菌O157：H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究 被引量：9
9
作者 张雪寒 何孔旺 +10 位作者 卢维彩 赵攀登 温立斌 李彬 郭容利 王小敏 倪艳秀 周俊明 俞正玉 茅爱华 吕立新 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2010年第4期180-185,共6页
为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b... 为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50LD50的EHECO157∶H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短。结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。 展开更多
关键词 EHECO157∶H7 转位紧密素受体 志贺毒素 融合基因 免疫原性
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Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒 被引量：10
10
作者 张雪寒 何孔旺 +2 位作者 缪文凯 茅爱华 俞正玉 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2008年第4期440-443,共4页
选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqm an探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV。利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80。pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧... 选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqm an探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV。利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80。pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线。以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测。该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数。PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出。用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒。建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 实时定量PCR TAQMAN探针 定量检测
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猪博卡病毒VP2基因的克隆与原核表达 被引量：8
11
作者 李彬 杜露平 +11 位作者 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 王小敏 周俊明 吕立新 俞正玉 胡屹屹 于洋 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第4期796-799,共4页
为研究猪博卡病毒VP2蛋白的功能及其在疫病诊断中的作用,对其基因进行了克隆和原核表达。根据猪博卡病毒基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了1对引物,采用PCR方法扩增猪博卡病毒的VP2基因,并将其克隆到表达载体pET32a(+)... 为研究猪博卡病毒VP2蛋白的功能及其在疫病诊断中的作用,对其基因进行了克隆和原核表达。根据猪博卡病毒基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了1对引物,采用PCR方法扩增猪博卡病毒的VP2基因,并将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a-VP2,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为49 000的融合蛋白,蛋白质表达量较高,且以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western blot结果显示,表达的VP2蛋白能与His抗体发生特异性免疫反应。说明该试验成功克隆了猪博卡病毒的VP2基因并进行了原核表达,为研究该蛋白的功能及建立血清学诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 猪博卡病毒 VP2 基因 克隆 原核表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离鉴定及遗传变异分析 被引量：11
12
作者 王小敏 何孔旺 +9 位作者 周忠涛 茅爱华 俞正玉 汪伟 倪艳秀 温立斌 张雪寒 郭容利 李彬 于洋 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期232-238,共7页
从江苏某猪繁殖与呼吸综合征（ PRRS）发病猪场采集的血清样本中分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）毒株,对该毒株的生物学特性进行了鉴定,并对其Nsp2和ORF5序列进行测定和序列比对分析。利用细胞传代的方法对PRRSV检测阳性,PPV... 从江苏某猪繁殖与呼吸综合征（ PRRS）发病猪场采集的血清样本中分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）毒株,对该毒株的生物学特性进行了鉴定,并对其Nsp2和ORF5序列进行测定和序列比对分析。利用细胞传代的方法对PRRSV检测阳性,PPV和PRV检测阴性的猪血清进行病毒分离。通过RT-PCR、CPE和IFA对PRRSV分离毒株进行鉴定,并测定其TCID50。测序获得Nsp2和ORF5基因,并利用DNAStar软件进行序列同源性和进化分析。成功分离获得1株PRRSV毒株,该毒株能够在Marc-145细胞上增殖并产生细胞病变,免疫荧光检测可观察到特异性荧光,TCID50为105.5。 Nsp2序列分析表明,该分离株具有HP-PRRSV 30个氨基酸缺失的基因特征,同时495-516位也存在缺失。分离株ORF5基因与其他参考毒株氨基酸同源性为57.1%-99.5%,与NJ-1106的同源性最高,为99.5%。系统进化树分析表明,该分离株属于北美型,与WUH4、NJ-1106等HP-PRRSV毒株属于同一分支。本试验分离得到一株HP-PRRSV变异毒株,为分析我国PRRSV的遗传变异和防控奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分离与鉴定 遗传变异
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2009～2010年华东地区猪圆环病毒2型的基因型分析 被引量：8
13
作者 王小敏 张文文 +9 位作者 何孔旺 茅爱华 俞正玉 温立斌 倪艳秀 张雪寒 郭容利 吕立新 李彬 周俊明 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第5期1037-1042,共6页
为分析2009～2010年中国华东地区猪圆环病毒2型(PCV2)的基因型分布情况,应用可以区分PCV2a和PCV2b的鉴别PCR,对浙江、江苏、安徽、山东、上海、江西等6省市的210份血液和组织样品进行PCV2检测,并选取10份阳性病料进行全长基因组扩增,应... 为分析2009～2010年中国华东地区猪圆环病毒2型(PCV2)的基因型分布情况,应用可以区分PCV2a和PCV2b的鉴别PCR,对浙江、江苏、安徽、山东、上海、江西等6省市的210份血液和组织样品进行PCV2检测,并选取10份阳性病料进行全长基因组扩增,应用DNAStar软件对获得的10株PCV全长基因和GenBank中的参考毒株进行序列分析和系统进化树分析。结果表明210份病料中107份为PCV2阳性,36份为PCV2a基因型,97份为PCV2b基因型,检出率分别为17.1%和46.2%,两个基因型的共感染率为12.4%。10株分离株的序列分析结果表明,华东地区PCV2流行毒株之间的核苷酸同源性为96.3%～99.9%,与GenBank其他PCV2参考毒株的同源性为95.0%～99.9%。系统进化树分析表明中国华东地区PCV2存在3种基因型:PCV2a、PCV2b和PCV2c。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) 序列分析 基因型 华东地区
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EHEC O157：H7二重PCR的建立及应用 被引量：7
14
作者 李丽 张雪寒 +13 位作者 何孔旺 姜平 赵攀登 叶青 栾晓婷 温立斌 倪艳秀 周俊明 吕立新 郭容利 俞正玉 茅爱华 李彬 王小敏 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期59-66,共8页
建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以E... 建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。 展开更多
关键词 O157:H7 二重PCR 方法建立 细菌分离 样品检测
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某进口原种猪场仔猪猪瘟首免日龄的确定与分析 被引量：10
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作者 赵永前 孙华伟 +1 位作者 张敬峰 茅爱华 《江苏农业科学》 北大核心 2016年第6期354-356,共3页
为探索适合于猪场实际需要的仔猪猪瘟首免日龄,利用IDEXX公司的试剂盒,对安徽省某进口原种猪场第1批产仔母猪所产的6窝仔猪进行猪瘟抗体消退规律的跟踪监测。结果显示:仔猪45日龄时的猪瘟水平符合IDEXX公司推荐的"在仔猪猪瘟抗体... 为探索适合于猪场实际需要的仔猪猪瘟首免日龄,利用IDEXX公司的试剂盒,对安徽省某进口原种猪场第1批产仔母猪所产的6窝仔猪进行猪瘟抗体消退规律的跟踪监测。结果显示:仔猪45日龄时的猪瘟水平符合IDEXX公司推荐的"在仔猪猪瘟抗体阳性率降至50%~60%、阻断率平均值降至40%~50%时对仔猪进行猪瘟疫苗的首免,在首免后4周进行二免"的仔猪猪瘟免疫方案中的猪瘟首免的条件,遂按上述方案对此批仔猪进行猪瘟疫苗的免疫。此批仔猪105日龄时的猪瘟抗体阳性率为93.8%,阻断率平均值为73%,抗体离散度为15.1%;同时,该猪场育种中心的记录显示:此批仔猪从出生到出栏全程育成率为97.1%,100 kg体质量时的日龄为143~157 d,2个指标均明显高于国内的平均水平。表明本次确定的仔猪猪瘟首免日龄是科学的,但仍有进一步提升的空间。试验为国内进口种猪场仔猪猪瘟免疫程序的制定提供了科学参考。 展开更多
关键词 进口原种猪 猪瘟抗体 首免日龄 检测 分析
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类猪圆环病毒因子P1核酸链型和极性的研究 被引量：8
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作者 温立斌 何孔旺 +8 位作者 倪艳秀 张雪寒 李彬 王小敏 郭容利 周俊明 俞正玉 茅爱华 吕立新 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2012年第3期120-122,共3页
研究报道类猪圆环病毒因子P1的核酸链型和极性的研究结果。采用氯化铯平衡密度梯度离心获得较为纯净的病毒粒子后,提取病毒DNA,经S1核酸酶消化、特异性单引物第一轮PCR扩增结合常规第二轮PCR扩增等研究,结果表明,类猪圆环病毒因子P1为... 研究报道类猪圆环病毒因子P1的核酸链型和极性的研究结果。采用氯化铯平衡密度梯度离心获得较为纯净的病毒粒子后,提取病毒DNA,经S1核酸酶消化、特异性单引物第一轮PCR扩增结合常规第二轮PCR扩增等研究,结果表明,类猪圆环病毒因子P1为单股、负链基因组。 展开更多
关键词 类猪圆环病毒因子P1 核酸链型 极性
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猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用 被引量：5
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作者 李彬 刘浩飞 +14 位作者 孙冰 茅爱华 杜露平 何孔旺 郭容利 温立斌 张雪寒 倪艳秀 周俊明 吕立新 俞正玉 王小敏 胡屹屹 祝昊丹 于洋 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期125-129,共5页
为定量检测猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,建立了检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法.根据PEDV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果表明... 为定量检测猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,建立了检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法.根据PEDV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果表明,该试验建立的荧光定量PCR方法在1μl 10^1 ～ 10^9拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90％与100％之间.该方法的检测灵敏度为10拷贝,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高,而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应,批内和批间的变异系数均低于3％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的130份临床样品进行检测,结果显示,PEDV的阳性率为63.1％. 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 TAQMAN 荧光定量 PCR 流行病学调查
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断奶仔猪多系统衰竭综合征相关病原混合感染的流行病学调查 被引量：10
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作者 曹东阳 王小敏 +2 位作者 茅爱华 何孔旺 钱爱东 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第12期3383-3391,共9页
为了解中国江苏省及周边地区猪场断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相关病原的流行情况,本研究采用PCR方法,对2014年1月至2015年5月采自江苏、安徽及浙江等地猪场的125份健康猪样品和261份发病猪样品分别进行猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖... 为了解中国江苏省及周边地区猪场断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相关病原的流行情况,本研究采用PCR方法,对2014年1月至2015年5月采自江苏、安徽及浙江等地猪场的125份健康猪样品和261份发病猪样品分别进行猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、输血性传播病毒(TTV)和类猪圆环病毒P1的检测。结果显示,所有样品PCV2、PRRSV、PPV、TTV1、TTV2和P1的阳性率分别为39.38%、21.76%、3.11%、15.80%、16.32%和10.10%,其中混合感染主要存在于PMWS的发病猪群,以PCV2与TTV2(15.32%)和PCV2与PRRSV(11.87%)的混合感染为主。结果表明,江苏省及周边地区猪场普遍存在PMWS相关病原的混合感染现象,加大了PMWS相关病原的防控难度。 展开更多
关键词 断奶仔猪多系统衰竭综合征 多病原混合感染 流行病学调查
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猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用 被引量：9
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作者 肖琦 茅爱华 +13 位作者 汪伟 俞正玉 郭佳慧 袁万哲 赵攀登 温立斌 范宝超 李彬 朱雪蛟 胡屹屹 郭容利 曲梦 杨倩 何孔旺 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第2期9-14,共6页
根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒... 根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。 展开更多
关键词 圆环病毒3型 PCR 临床应用
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性 被引量：5
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作者 张雪寒 何孔旺 +11 位作者 赵攀登 栾晓婷 叶青 温立斌 李彬 王小敏 郭容利 倪艳秀 周俊明 俞正玉 茅爱华 吕立新 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第5期1021-1025,共5页
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EH... 肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 flic基因 表达 小鼠
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