目的构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体。方法根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR位点,下游引入Sal位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC1...目的构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体。方法根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR位点,下游引入Sal位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中,获得重组质粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoR与Sal酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4,EcoR/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序。转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-hBMP-4重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确;AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1.5×1012μg/ml,分泌蛋白浓度为0.124mg/ml,病毒载体纯度在95%以上。结论实验获得的病毒载体滴度高、感染性好,可以满足骨组织工程的需要。展开更多
文摘目的构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体。方法根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR位点,下游引入Sal位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中,获得重组质粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoR与Sal酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4,EcoR/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序。转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-hBMP-4重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确;AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1.5×1012μg/ml,分泌蛋白浓度为0.124mg/ml,病毒载体纯度在95%以上。结论实验获得的病毒载体滴度高、感染性好,可以满足骨组织工程的需要。
