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苏云金芽孢杆菌分子伴侣串联基因p19-p29的克隆和表达载体的构建 被引量:5
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作者 余健秀 曾少灵 +2 位作者 谢瑞瑜 蒙国基 庞义 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期567-572,共6页
根据已知序列设计一对PCR引物 (ORF 5S ,ORF 3N) ,可从cry2Aa或cry2Ac操纵子中扩增出包含串联分子伴侣基因p1 9 p2 9的DNA片段 ,预期大小分别为 1 6kb和 2 0kb。对 1 5 0株苏云金芽孢杆菌菌株进行PCR检测 ,从 2 6株中获得了大小为 1 ... 根据已知序列设计一对PCR引物 (ORF 5S ,ORF 3N) ,可从cry2Aa或cry2Ac操纵子中扩增出包含串联分子伴侣基因p1 9 p2 9的DNA片段 ,预期大小分别为 1 6kb和 2 0kb。对 1 5 0株苏云金芽孢杆菌菌株进行PCR检测 ,从 2 6株中获得了大小为 1 6kb的扩增片段 ,但未获得2 0kb的片段。这表明cry2Aa型操纵子p1 9 p2 9基因存在较广泛 ,而cry2Ac型较罕见。将来自Y2 菌株的 1 6kb片段回收 ,通过一系列亚克隆 ,最终构建成一个含有p1 9 p2 9串联基因的Bt表达载体 ,为进一步研究p1 9 p2 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 分子伴侣 串联基因 p19-p29 克隆 表达载体
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苏云金芽孢杆菌cry3Aa启动子的克隆和营养期表达载体的构建 被引量:4
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作者 余健秀 蒙国基 +3 位作者 曾少灵 谢瑞瑜 谭乐 庞义 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2001年第3期5-8,14,共5页
苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis ,Bt)的绝大多数杀虫晶体蛋白 (insectici dalcrystalproteins,ICPs)基因是在芽孢形成期 (sporulationphase)表达的 ,而只有少数基因如cry3Aa是在营养期表达的。在本研究中 ,根据已知的cry3Aa基... 苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis ,Bt)的绝大多数杀虫晶体蛋白 (insectici dalcrystalproteins,ICPs)基因是在芽孢形成期 (sporulationphase)表达的 ,而只有少数基因如cry3Aa是在营养期表达的。在本研究中 ,根据已知的cry3Aa基因启动子序列设计了一对引物 (Ep 5s和Ep 3n) ,利用这对引物从拟步虫甲亚种 (Btsubsp .tenebrions)中扩增出一个与预期大小 ( 1.1kb)一致的DNA片段。序列测定及分析结果表明 ,这个DNA片段含cry3Aa启动子全序列 ,包括上游AT富含区、两个启动子区、两个SD序列及两组反向重复序列。经过一系列的克隆之后将这个片段克隆到穿梭载体pHT310 1上 ,最后构建成一个Bt的营养期表达载体 pHPT。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 cry3Aa基因 启动子 营养期 表达载体 生物杀虫剂
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变速上样在MabSelect填料上分离WLB303单克隆抗体的研究
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作者 蒙国基 邓义熹 +2 位作者 李乐 罗豪晖 于玉根 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期65-75,共11页
随着抗体表达量的提升和生产规模的扩大,Protein A亲和层析不仅需要高载量填料,也需要提高工艺效率。变速上样的方法可以在满足载量要求的同时大大缩短工艺耗时。通过测定WLB303单克隆抗体在GE Mab Select填料多个保留时间的动态载量,... 随着抗体表达量的提升和生产规模的扩大,Protein A亲和层析不仅需要高载量填料,也需要提高工艺效率。变速上样的方法可以在满足载量要求的同时大大缩短工艺耗时。通过测定WLB303单克隆抗体在GE Mab Select填料多个保留时间的动态载量,建立一元三次方程拟合载量和保留时间的关系。以该方程计算获得填料在快、中、慢速下不同保留时间的动态载量表,并以此作为变速上样组合的参考依据。在2.7ml层析柱上使用精纯样品测试最快的变速上样组合的可行性;然后用常规纯化工艺在7ml层析柱上使用细胞培养澄清液,对最快的变速上样组合和恒速上样的两种工艺周期进行了比较,证实变速上样的方式能明显提升整体工艺效率。 展开更多
关键词 ProteinA亲和层析 变速上样 动态载量 工艺效率 单克隆抗体
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几种Protein A亲和层析填料纯化重组单克隆抗体效果的比较 被引量:5
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作者 何凌冰 李乐 +2 位作者 邓义熹 蒙国基 于玉根 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期72-77,共6页
随着表达技术的进步以及发酵技术的优化,细胞发酵上清液中抗体的滴度大幅度提高,必然对下游纯化工艺的处理能力有更高的要求。Protein A亲和层析是分离单克隆抗体的一种标准纯化方法。目前已经有很多种protein A亲和填料,其配体基本上... 随着表达技术的进步以及发酵技术的优化,细胞发酵上清液中抗体的滴度大幅度提高,必然对下游纯化工艺的处理能力有更高的要求。Protein A亲和层析是分离单克隆抗体的一种标准纯化方法。目前已经有很多种protein A亲和填料,其配体基本上都是大肠杆菌发酵的重组protein A。不同厂家生产的protein A填料有各自不同的基质或键合技术,从而造成填料对抗体亲和力以及对碱耐受性的差异。针对正在研发的WLB303单克隆抗体,比较了6种不同的protein A填料的动态载量,并从洗脱溶液种类和p H两个方面进行单克隆抗体纯化条件的筛选,分析纯化后样品SEC纯度和回收率。综合考虑载量、除杂效果、回收率三个因素,Mab Select填料是最适合本抗体纯化的,SEC纯度可以达到98%,回收率可以达到100%左右。基于这些数据,对Mab Select填料进行了使用寿命试验,200次循环之后载量仅衰减了5%。 展开更多
关键词 ProteinA 动态载量 SEC纯度 回收率
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重组抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体酸性异构体去除工艺的优化
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作者 李乐 蒙国基 于玉根 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期169-175,共7页
目的优化重组抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体纯化工艺中去除酸性异构体的条件。方法考察重组抗HER2单克隆抗体在阳离子交换层析工艺过程中的洗脱方式、预洗缓冲液pH、预洗缓冲液盐浓... 目的优化重组抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体纯化工艺中去除酸性异构体的条件。方法考察重组抗HER2单克隆抗体在阳离子交换层析工艺过程中的洗脱方式、预洗缓冲液pH、预洗缓冲液盐浓度、预洗体积、填料负载抗体量等条件对酸性异构体去除效果的影响,筛选最适工艺条件。采用最适条件对中试放大工艺的4批重组抗HER2单克隆抗体进行检测,验证其适用性。结果最适工艺条件为:纯化上样填料负载抗体量应≥60 g/L;在上样/淋洗后添加pH 8.0的20 mmol/L Tris-HCl及15 mmol/L NaCl(电导率为3.0 mS/cm),3倍柱体积预洗;预洗后用平衡缓冲液再平衡5倍柱体积,之后一步洗脱。该工艺条件能将目的组分含量从工艺优化前的53%提高至65%,酸性异构体含量从工艺优化前的35%降至25%以下,电荷分布与原研对照药一致;4批中试样品中抗体负载量≥60 g/L的3批放大验证结果达到原研对照药相关质量指标要求。结论优化的阳离子交换层析去除酸性异构体工艺简单有效、易操作,适用于中试放大工艺。 展开更多
关键词 重组抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体 酸性异构体 PH 分子排阻/离子交换高效液相色谱 回收率
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添加SNS能显著提高CHT填料使用寿命的研究
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作者 邓义熹 李继东 +2 位作者 李乐 蒙国基 于玉根 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期81-88,共8页
陶瓷羟基磷灰石广泛用于各种生物分子的分离和纯化,但在层析应用上,纯化洗脱过程中填料表面氢原子的释放容易导致其性能和寿命降低。研究了一种可以延长CHT填料使用寿命的方法,通过在洗脱步骤前加入一种称为表面中和体系(SNS)的溶液,结... 陶瓷羟基磷灰石广泛用于各种生物分子的分离和纯化,但在层析应用上,纯化洗脱过程中填料表面氢原子的释放容易导致其性能和寿命降低。研究了一种可以延长CHT填料使用寿命的方法,通过在洗脱步骤前加入一种称为表面中和体系(SNS)的溶液,结合释放的氢原子,使得整个体系处于一个接近中性pH的状态。先筛选出有效调整pH的SNS条件,通过钙离子流失的监测证实该条件的有效性。再通过在WLB304单克隆抗体纯化工艺中加入SNS之后,对羟基磷灰石填料载量、pH和压力的变化、杂质的去除能力进行考察。结果表明,加入SNS可以有效减少钙离子流失,同时并不会影响CHT层析工艺的效果。 展开更多
关键词 陶瓷羟基磷灰石 SNS 钙流失 单克隆抗体
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一种快速检测陶瓷羟基磷灰石层析过程中钙离子流失量方法的建立及验证
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作者 李继东 邓义熹 +1 位作者 蒙国基 于玉根 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第1期77-80,共4页
目的建立一种快速检测陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析过程中钙离子(Ca^(2+))流失量的方法,并进行验证。方法分析钠离子(Na^+)和磷酸根离子(PO_4^(3-))的浓度对Ca^(2+)含量测定试剂盒检测结果的影响。配制含不同浓度PO_4^(3-)(1、10、20 mmol/L... 目的建立一种快速检测陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析过程中钙离子(Ca^(2+))流失量的方法,并进行验证。方法分析钠离子(Na^+)和磷酸根离子(PO_4^(3-))的浓度对Ca^(2+)含量测定试剂盒检测结果的影响。配制含不同浓度PO_4^(3-)(1、10、20 mmol/L)的缓冲液A、B、C,用该方法平行检测5次,验证该方法的线性、重复性、准确性。采用该方法检测CHT层析各步骤收获液中Ca^(2+)含量。结果 Na^+(0~100 mmol/L)和一定浓度范围(0~20 mmol/L)的PO_4^(3-)不影响Ca^(2+)含量测定试剂盒的检测结果。Ca^(2+)浓度在0~20 mmol/L范围内,线性关系良好,直线回归相关系数(R^2)>0.99,5次检测结果的RSD<3%,准确性均为95%~105%。CHT层析过程中平衡和洗脱步骤每个柱体积(column volumn,CV)收获液中Ca^(2+)浓度的RSD均<3%。结论该方法具有良好的精密性及准确性,可有效检测层析工艺中各步骤的Ca^(2+)流失量。 展开更多
关键词 陶瓷羟基磷灰石层析 钙离子 流失量
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