目的探讨干扰或过表达动力蛋白重链(dynein heavy chain,Dynhc)基因后,帕金森病(Parkinson disease,PD)模型细胞中α-突触核蛋白的自噬溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway,ALP)降解机制。方法按实验要求将SH-SY5Y细胞分为对照组、P...目的探讨干扰或过表达动力蛋白重链(dynein heavy chain,Dynhc)基因后,帕金森病(Parkinson disease,PD)模型细胞中α-突触核蛋白的自噬溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway,ALP)降解机制。方法按实验要求将SH-SY5Y细胞分为对照组、PD组、Dynhc干扰组、Dynhc过表达组、Dynhc干扰+雷帕霉素组。用Western blot检测细胞中Dynhc、α-突触核蛋白、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3,LC3)、溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)、微管蛋白、动力蛋白激活蛋白p150、驱动蛋白KIF5B的蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;免疫共聚焦镜观察微管蛋白结构以及LC3与LAMP的共定位情况。采用SPSS 23.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果5组细胞α-突触核蛋白、自噬标记蛋白、微管及微管相关蛋白表达均差异有统计学意义(均P<0.001)。PD组Dynhc、α-突触核蛋白、LC3、LAMP2、p150、KIF5B的蛋白表达水平均高于对照组(均P<0.05);Dynhc干扰组Dynhc、LAMP2、微管蛋白、p150的蛋白表达水平均低于PD组(均P<0.05),α-突触核蛋白、LC3、KIF5B的蛋白表达水平均高于PD组(均P<0.05);Dynhc过表达组α-突触核蛋白、LC3、KIF5B的蛋白表达水平均低于PD组(均P<0.05),Dynhc、LAMP2、p150的蛋白表达水平高于PD组(均P<0.05);Dynhc干扰+雷帕霉素组LC3的蛋白表达水平高于Dynhc干扰组(P<0.05),Dynhc、α-突触核蛋白、LAMP2、微管蛋白、p150、KIF5B的蛋白表达水平与Dynhc干扰组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比,PD组细胞凋亡水平提高[(12.77±1.66)%,(7.64±1.45)%],微管形态不变,自噬体与溶酶体融合较多;与PD组比,Dynhc干扰组细胞凋亡水平[(18.45±1.91)%]提高,微管形态稀疏,自噬体与溶酶体融合较少;与PD组比,Dynhc过表达组细胞凋亡水平[(9.95±1.56)%]降低,微管结构无明显改变,自噬体与溶酶体融合较多;与Dynhc干扰组比,Dynhc干扰+雷帕霉素组细胞凋亡水平[(19.05±2.46)%]、微管形态、自噬体与溶酶体融合无明显改变。结论Dynhc可以提高细胞自噬溶酶体途径降解功能,并通过增加α-突触核蛋白降解以及维持微管结构完整使细胞凋亡减少。展开更多
文摘目的探讨干扰或过表达动力蛋白重链(dynein heavy chain,Dynhc)基因后,帕金森病(Parkinson disease,PD)模型细胞中α-突触核蛋白的自噬溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway,ALP)降解机制。方法按实验要求将SH-SY5Y细胞分为对照组、PD组、Dynhc干扰组、Dynhc过表达组、Dynhc干扰+雷帕霉素组。用Western blot检测细胞中Dynhc、α-突触核蛋白、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3,LC3)、溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)、微管蛋白、动力蛋白激活蛋白p150、驱动蛋白KIF5B的蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;免疫共聚焦镜观察微管蛋白结构以及LC3与LAMP的共定位情况。采用SPSS 23.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果5组细胞α-突触核蛋白、自噬标记蛋白、微管及微管相关蛋白表达均差异有统计学意义(均P<0.001)。PD组Dynhc、α-突触核蛋白、LC3、LAMP2、p150、KIF5B的蛋白表达水平均高于对照组(均P<0.05);Dynhc干扰组Dynhc、LAMP2、微管蛋白、p150的蛋白表达水平均低于PD组(均P<0.05),α-突触核蛋白、LC3、KIF5B的蛋白表达水平均高于PD组(均P<0.05);Dynhc过表达组α-突触核蛋白、LC3、KIF5B的蛋白表达水平均低于PD组(均P<0.05),Dynhc、LAMP2、p150的蛋白表达水平高于PD组(均P<0.05);Dynhc干扰+雷帕霉素组LC3的蛋白表达水平高于Dynhc干扰组(P<0.05),Dynhc、α-突触核蛋白、LAMP2、微管蛋白、p150、KIF5B的蛋白表达水平与Dynhc干扰组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比,PD组细胞凋亡水平提高[(12.77±1.66)%,(7.64±1.45)%],微管形态不变,自噬体与溶酶体融合较多;与PD组比,Dynhc干扰组细胞凋亡水平[(18.45±1.91)%]提高,微管形态稀疏,自噬体与溶酶体融合较少;与PD组比,Dynhc过表达组细胞凋亡水平[(9.95±1.56)%]降低,微管结构无明显改变,自噬体与溶酶体融合较多;与Dynhc干扰组比,Dynhc干扰+雷帕霉素组细胞凋亡水平[(19.05±2.46)%]、微管形态、自噬体与溶酶体融合无明显改变。结论Dynhc可以提高细胞自噬溶酶体途径降解功能,并通过增加α-突触核蛋白降解以及维持微管结构完整使细胞凋亡减少。
