重组抗肿瘤抗病毒蛋白乐复能质控方法与质量标准的建立 被引量：4

1

作者 裴德宁 饶春明 +3 位作者 李永红 韩春梅 任跃明 王军志 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期364-368,共5页

目的:建立重组抗肿瘤抗病毒蛋白乐复能(novaferon)的质控方法和质量标准。方法:以WST-1染色法检测Daudi细胞增殖,测定乐复能的抗肿瘤细胞增殖活性;以WISH细胞病变抑制法测定乐复能抗病毒活性;乐复能以胰蛋白酶酶切后,用HPLC分析肽图;其... 目的:建立重组抗肿瘤抗病毒蛋白乐复能(novaferon)的质控方法和质量标准。方法:以WST-1染色法检测Daudi细胞增殖,测定乐复能的抗肿瘤细胞增殖活性;以WISH细胞病变抑制法测定乐复能抗病毒活性;乐复能以胰蛋白酶酶切后,用HPLC分析肽图;其余检测项目按《中华人民共和国药典》(三部)2005年版的规定进行。结果:3批乐复能原液和成品的抗肿瘤比活性均≥2.0×106U/mg、抗病毒比活性均≥1.0×109IU/mg。3批乐复原液的HPLC肽图与参考品一致,乐复原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、末端氨基酸序列等指标及成品的细菌内毒素、苯甲酸含量、乙腈残留量等指标均符合规定。根据检定结果建立了乐复能的质量标准。结论:建立的质控方法和质量标准可以保证乐复能的安全、有效和质量可控,可用于乐复能的常规检定。 展开更多

关键词 抗肿瘤抗病毒蛋白 乐复能 质量标准 生物学活性

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应用shRNA技术研究NDRG2在人胃癌细胞SGC7901增殖中的作用 被引量：4

2

作者 裴德宁 张翊 +1 位作者 饶春明 王军志 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1021-1025,共5页

目的:构建针对人 N-myc 下游调节基因2(NDRG2)的短发夹 RNA(shRNA)表达载体 pSNAV-shRNA,观察其在SGC7901细胞中对 NDRG2的抑制作用以及 NDRG2被抑制后细胞增殖能力的变化。方法:PCR 扩增针对 NDRG2的 shRNA 表达框架,构建 pSNAV-shRNA... 目的:构建针对人 N-myc 下游调节基因2(NDRG2)的短发夹 RNA(shRNA)表达载体 pSNAV-shRNA,观察其在SGC7901细胞中对 NDRG2的抑制作用以及 NDRG2被抑制后细胞增殖能力的变化。方法:PCR 扩增针对 NDRG2的 shRNA 表达框架,构建 pSNAV-shRNA 质粒,转染 SGC7901细胞,通过 RT-PCR,免疫印迹试验检测其对 NDRG2表达的影响;通过细胞周期分析,软琼脂集落形成试验检测细胞增殖能力的变化。结果:将构建好的 pSNAV-shRNA 质粒转染 SGC7901细胞后,NDRG2的表达受到明显的抑制,细胞周期 G1期阻滞,集落形成能力降低。结论:构建的 pSNAV-shRNA 质粒能够有效抑制NDRG2在 SGC7901细胞中的表达,降低 SGC7901细胞的增殖能力。 展开更多

关键词 RNA干扰 短发夹RNA(shRNA) 人N-myc下游调节基因2(NDRG2) 胃肿瘤

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重组人干扰素α2a注射剂评价性抽验结果与质量分析 被引量：6

3

作者 裴德宁 郭莹 +4 位作者 李永红 韩春梅 丁有学 李响 饶春明 《中国药师》 CAS 2015年第1期52-55,共4页

目的:评价国产重组人干扰素α2a注射剂的质量现状及存在问题。方法:采用法定检验方法结合探索性研究进行样品检验,统计分析检验结果,对国产重组人干扰素α2a注射剂的质量现状进行评价。结果:法定检验显示28批成品全部合格,7批原液全部合... 目的:评价国产重组人干扰素α2a注射剂的质量现状及存在问题。方法:采用法定检验方法结合探索性研究进行样品检验,统计分析检验结果,对国产重组人干扰素α2a注射剂的质量现状进行评价。结果:法定检验显示28批成品全部合格,7批原液全部合格(部分检验)。探索性研究显示若在成品中增加比活性测定,则合格率为87.0%,若在原液中增加相关蛋白含量测定,则合格率为57.1%。结论:该品种总体质量状况良好,现行检验标准基本可行,但有待提高,建议在成品中增加比活性检测,在原液中增加相关蛋白含量检测。 展开更多

关键词 重组人干扰素Α2A 评价性抽验 质量分析

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报告基因法测定聚乙二醇化Ⅰ型干扰素生物学活性的研究 被引量：3

4

作者 裴德宁 于雷 +2 位作者 郭莹 史新昌 饶春明 《中国医药导报》 CAS 2018年第1期22-25,共4页

目的考察《中国药典》(2015年版)中报告基因法测定聚乙二醇化Ⅰ型干扰素生物学活性的方法适用性。方法根据ICH指导原则,验证报告基因法的专属性、线性、准确性(回收率)、精密度(重复性、中间精密度)等指标,并对报告基因法与病毒抑制法... 目的考察《中国药典》(2015年版)中报告基因法测定聚乙二醇化Ⅰ型干扰素生物学活性的方法适用性。方法根据ICH指导原则,验证报告基因法的专属性、线性、准确性(回收率)、精密度(重复性、中间精密度)等指标,并对报告基因法与病毒抑制法的测定结果进行比较。结果使用报告基因法测定聚乙二醇Ⅰ型干扰素活性具有良好的专属性,剂量反应关系符合四参数方程,回收率为85%~115%,重复性为6.66%~7.70%,不同测定日期、不同实验员和不同细胞代次的中间精密度分别为10.64%~11.01%、13.04%~15.12%和7.61%~8.54%,报告基因法与病毒抑制法的测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论报告基因法可以用于聚乙二醇化Ⅰ型干扰素生物学活性测定。 展开更多

关键词 聚乙二醇化Ⅰ型干扰素 生物学活性 报告基因法 方法学验证

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国产重组人干扰素α2b注射剂渗透压摩尔浓度测定结果分析 被引量：2

5

作者 裴德宁 李响 +2 位作者 郭莹 韩春梅 饶春明 《中国药师》 CAS 2015年第11期1997-2000,共4页

目的：考察国产重组人干扰素α2b注射剂的渗透压摩尔浓度,为该品种渗透压摩尔浓度质量标准的完善提供依据。方法：抽取9家企业的66批产品,根据《中国药典》2010年版三部测定其渗透压摩尔浓度,并对测定结果进行统计分析。结果：渗透压摩... 目的：考察国产重组人干扰素α2b注射剂的渗透压摩尔浓度,为该品种渗透压摩尔浓度质量标准的完善提供依据。方法：抽取9家企业的66批产品,根据《中国药典》2010年版三部测定其渗透压摩尔浓度,并对测定结果进行统计分析。结果：渗透压摩尔浓度的合格率为98.5%,90%以上的批次渗透压摩尔浓度在企业规定的渗透压摩尔浓度中间值的85%-115%之间。结论：对国产重组人干扰素α2b注射剂渗透压摩尔浓度的质控状况有了比较全面的了解,为渗透压摩尔浓度质量标准的完善提供了数据支持。 展开更多

关键词 评价性抽验 渗透压摩尔浓度 冰点下降法

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重组人干扰素α1b质量肽图分析及二硫键定位 被引量：14

6

作者 饶春明 陶磊 +4 位作者 史新昌 杨英 韩春梅 裴德宁 王军志 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1505-1510,共6页

目的:液质联用绘制重组人干扰素α1b 的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法:LC-MS 联用绘制重组人干扰素α1b 的胰蛋白酶酶切质量肽图;对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键,对比烷基化及还原烷基化处理后特定... 目的:液质联用绘制重组人干扰素α1b 的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法:LC-MS 联用绘制重组人干扰素α1b 的胰蛋白酶酶切质量肽图;对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键,对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果:重组人干扰素α1b 的质谱测定相对分子质量为19382.50,与理论相对分子质量19382.18一致,其质量肽图中共发现16个匹配肽段,有3个理论酶切片段(单一氨基酸:Lys 135、Lys 165、Glu 166)未发现,氨基酸覆盖率为98.2%。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图,发现主要存在2种二硫键连接方式:Cys 29-Cys 139、Cys 86-Cys 99,同时还存在少量其他二硫键连接方式,如:C1-C99。结论:质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段,并可定位蛋白中的二硫键。 展开更多

关键词 液质联用 质量肽图 还原烷基化

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重组人干扰素-α2a(IFN-α2a)的圆二色谱分析 被引量：5

7

作者 史新昌 饶春明 +5 位作者 裴德宁 刘兰 韩春梅 赵阳 张翊 王军志 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1169-1172,共4页

目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 ... 目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱进行了比较。结果:测量温度在60～95℃之间,rhIFN-α 2a 圆二色谱的形状发生改变,三级结构遭到破坏,二级结构发生改变;在5～60℃温度区间,二级结构相对稳定。rhIFN-α2a 的各二级结构比例在1.5～0.006nag·mL^(-1)范围内相对稳定。不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱形状基本一致,4种二级结构的比例相近。结论:在一定的温度和浓度范围内,rhIFN-α 2a 的圆二色谱相对稳定,且不同批次的测量结果具有很好的一致性。圆二色谱可用于蛋白质类药物的质量控制。 展开更多

关键词 重组人干扰素-α2a 圆二色谱 二级结构 质量控制 rhIFN-α 干扰素-Α 重组人 色谱分析 IFN-Α2A 测量温度

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重组人NDRG2蛋白对肿瘤细胞抑制作用研究 被引量：5

8

作者 张翊 陈杰 +3 位作者 裴德宁 饶春明 药立波 王军志 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2004年第3期204-207,共4页

目的:考察原核表达的重组人NDRG2蛋白对肿瘤细胞的作用。方法:通过设置不同浓度的蛋白剂量并设置对照 组,采用细胞MTT比色法和细胞计数检测NDRG2蛋白对7901、HHCC细胞的抑制效果,流式细胞仪检测细胞周期的变化,体 内实验采用裸鼠抑瘤试... 目的:考察原核表达的重组人NDRG2蛋白对肿瘤细胞的作用。方法:通过设置不同浓度的蛋白剂量并设置对照 组,采用细胞MTT比色法和细胞计数检测NDRG2蛋白对7901、HHCC细胞的抑制效果,流式细胞仪检测细胞周期的变化,体 内实验采用裸鼠抑瘤试验。结果:重组人NDRG2对肿瘤细胞生长有较强的抑制作用,约50μg/ml浓度时对肿瘤细胞生长的 抑制作用明显,流式细胞术结果显示肿瘤细胞G1期变化,体外能抑制裸鼠肿瘤的生成。结论:重组人NDRG2蛋白在体内体 外具有一定的抑制肿瘤细胞生长作用,在肿瘤治疗方面将具有一定的意义。 展开更多

关键词 NDRG2 HHCC细胞 7901细胞 肿瘤抑制

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RNA干扰研究进展 被引量：8

9

作者 张翊 裴德宁 王军志 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2003年第1期68-70,共3页

RNA干扰能使特异基因沉默 ,目前RNA干扰研究成为热点 ,并成功的在哺乳动物细胞和小鼠体内抑制部分基因的表达 ,本文介绍了目前RNA干扰作用机理、导入技术和应用的研究进展 ,可以预见RNA干扰技术在基因功能研究。

关键词 RNA干扰 基因沉默 双链RNA 反义RNA

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毛细管SDS无胶筛分电泳测定小分子多肽相对分子质量 被引量：4

10

作者 李响 饶春明 +3 位作者 袁力勇 郭莹 裴德宁 王军志 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第2期122-124,共3页

目的建立快速毛细管SDS无胶筛分电泳法（SDS—NGS），测定小分子多肽相对分子质量。方法涂层毛细管（管长30cm，内径100μm）；分离电压为9kV（300V／cm），分离温度为20℃；检测波长为214nm，检测时间为18min；所用SDS-多肽相对分子质... 目的建立快速毛细管SDS无胶筛分电泳法（SDS—NGS），测定小分子多肽相对分子质量。方法涂层毛细管（管长30cm，内径100μm）；分离电压为9kV（300V／cm），分离温度为20℃；检测波长为214nm，检测时间为18min；所用SDS-多肽相对分子质量标准范围为2512—16949；以橙G（06）为内标参照物。结果在相对分子质量2512—16949范围内，多肽相对分子质量的对数与其相对迁移率具有良好的线性关系（r=0．996）；应用该方法测定了重组人奈西立肽、重组人表皮生长因子、虎纹镇痛肽、重组人心钠肽4种重组小分子多肽的相对分子质量，所测结果变异系数CV均小于3％。结论毛细管SDS无胶筛分电泳方便快速，灵敏度高，重现性好，结果准确，可作为小分子多肽相对分子质量的检测方法。 展开更多

关键词 毛细管SDS无胶筛分电泳 小分子多肽 相对分子质量

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质粒介导的NDRG2 shRNA抑制其在人肿瘤细胞HHCC中的表达 被引量：2

11

作者 张翊 裴德宁 +2 位作者 饶春明 药立波 王军志 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2004年第5期267-269,286,共4页

目的　构建含有针对NDRG2的shRNA的质粒 ,抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达。方法　用PCR方法从人基因组DNA中扩增出 336bp的U6 启动子 ,与 2 9bp的NDRG2靶序列的反向重复序列和pSNAV质粒相连。连接后的pSNAVU6 质粒转染入HHCC细胞 ,检测它... 目的　构建含有针对NDRG2的shRNA的质粒 ,抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达。方法　用PCR方法从人基因组DNA中扩增出 336bp的U6 启动子 ,与 2 9bp的NDRG2靶序列的反向重复序列和pSNAV质粒相连。连接后的pSNAVU6 质粒转染入HHCC细胞 ,检测它们对NDRG2表达的影响。结果　pSNAVU6 重组质粒能抑制NDRG2的表达。 展开更多

关键词 RNA干扰 质粒 人 肿瘤细胞 转录后基因沉默 表达 NDRG2

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重组人干扰素-γ与参考品圆二色谱图对比分析 被引量：2

12

作者 史新昌 饶春明 +3 位作者 毕华 裴德宁 李永红 王军志 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期481-485,共5页

目的:通过对重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)供试品与rhIFN-γ参考品和重组人干扰素-α2a(rhIFN-α2a)参考品圆二色谱图形比较,进而验证他们的结构是否一致。方法:分别独立处理rhIFN-γ供试品和rhIFN-γ参考品3次,每次分别在190～240nm波段(... 目的:通过对重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)供试品与rhIFN-γ参考品和重组人干扰素-α2a(rhIFN-α2a)参考品圆二色谱图形比较,进而验证他们的结构是否一致。方法:分别独立处理rhIFN-γ供试品和rhIFN-γ参考品3次,每次分别在190～240nm波段(远紫外区)和250～320nm波段(近紫外区)用圆二色谱测量,对得到的6组远紫外区数据和6组近紫外区数据,分波段进行相关性分析,然后对相关系数做统计分析;再用同样方法,对rhIFN-γ供试品和rhIFN-α2a参考品圆二色谱图形对比分析。结果:rhIFN-γ供试品和rhIFN-γ参考品在远紫外区和近紫外区圆二色谱图形没有差别;但rhIFN-γ供试品和rhIFN-α2a参考品在2个波段圆二色谱图形都有明显差别。结论:在远紫外区rhIFN-γ供试品和rhIFN-γ参考品圆二色谱图形的一致,说明两者二级结构比例相同,在近紫外区圆二色谱图形的一致,说明两者侧链生色团的排布相同,从而说明两者结构相同;而rhIFN-γ供试品和rhIFN-α2a参考品在远紫外区和近紫外区两者圆二色图形均不一致,说明二者在结构上不同。 展开更多

关键词 重组人干扰素-γ 圆二色谱 图形比对 质量控制

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小鼠NGF基因治疗型DNA质粒的构建及中试工艺的优化 被引量：1

13

作者 饶春明 袁力勇 +4 位作者 丁有学 刘兰 李响 郭莹 裴德宁 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第3期216-220,230,共6页

目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化。方法用SignalP3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DN... 目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化。方法用SignalP3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性。结果所构建的含有IgG/ngf的重组质粒,通过中试规模的发酵和纯化,获得了大量的高纯度重组质粒,该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF。结论构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒,并建立了中试生产工艺。 展开更多

关键词 神经生长因子 DNA质粒 生物学活性 中试工艺

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小鼠神经生长因子基因治疗型DNA质粒的质量控制 被引量：1

14

作者 袁力勇 饶春明 +4 位作者 韩春梅 刘兰 李响 郭莹 裴德宁 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第6期504-509,共6页

目的对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制。方法用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定... 目的对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制。方法用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用上述方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所采用的质控方法和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控。 展开更多

关键词 神经生长因子 DNA质粒 基因治疗 质量控制

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毛细管区带电泳法测定重组人干扰素α-1b滴眼液中间甲酚含量 被引量：2

15

作者 李响 于雷 +3 位作者 裴德宁 贾春翠 周勇 饶春明 《中国药师》 CAS 2018年第9期1575-1576,1585,共3页

目的:运用毛细管区带电泳法(CZE)检测重组人干扰素α^(-1)b(rh IFNα^(-1)b)滴眼液中间甲酚含量。方法:优化的CZE方法参数为采用无涂层的熔融石英毛细管(60 cm×50μm),电泳缓冲液为50 mmol·L^(-1)磷酸盐缓冲液(p H 8.0),压力... 目的:运用毛细管区带电泳法(CZE)检测重组人干扰素α^(-1)b(rh IFNα^(-1)b)滴眼液中间甲酚含量。方法:优化的CZE方法参数为采用无涂层的熔融石英毛细管(60 cm×50μm),电泳缓冲液为50 mmol·L^(-1)磷酸盐缓冲液(p H 8.0),压力进样(1.0 psi),分离电压25 k V,检测波长195 nm,毛细管温度25℃。结果:间甲酚在0.05~0.8 mg·ml^(-1)浓度范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.997 3),最低检出限0.002 mg·ml^(-1)。3批rh IFNα1b滴眼液中间甲酚的相对含量分别为1.94,1.89和1.97 mg·ml^(-1),平均回收率分别为94.3%(RSD=1.57%,n=9)。结果与HPLC方法结果基本一致。结论:新建毛细管区带电泳法简便,分析速度快,试剂消耗量小,结果准确,可以用于重组人干扰素α1b滴眼液中间甲酚含量的检测。 展开更多

关键词 重组人干扰素α-1b滴眼液 毛细管区带电泳 间甲酚

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血管内皮生长因子抑制剂结合活性试验两种结果分析方法比较

16

作者 毕华 李永红 +4 位作者 范文红 陶磊 裴德宁 丁有学 饶春明 《中国药事》 CAS 2019年第7期813-818,共6页

目的:对血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)结合活性试验两种结果分析方法进行比较,以考察两者的差异。方法:采用固定剂量的VEGF与系列稀释的VEGF Trap处理之后,检测未结合的VEGF的量,分别以未结合的VEGF量对VEGF Trap浓度梯度和未结合... 目的:对血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)结合活性试验两种结果分析方法进行比较,以考察两者的差异。方法:采用固定剂量的VEGF与系列稀释的VEGF Trap处理之后,检测未结合的VEGF的量,分别以未结合的VEGF量对VEGF Trap浓度梯度和未结合的VEGF检测板的OD值对VEGF Trap浓度梯度进行四参数方程拟合,两种方法计算该产品的结合活性。结果:两种方法均满足试验有效性条件,且血管内皮生长因子抑制剂供试品和标准品的半数抑制浓度(IC50)均分别为3.68和3.6pmoL·L-1,供试品的结合活性为102%。结论:证明了两种分析方法得到的结果完全一致。为同类产品结合活性计算方法的选择提供借鉴。 展开更多

关键词 血管内皮生长因子抑制剂 结合活性 半数抑制浓度 四参数方程

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基因治疗制品质量控制通用技术要求考虑要点

17

作者 史新昌 秦玺 +6 位作者 于雷 王光裕 陶磊 李响 裴德宁 李永红 周勇 《中国药品标准》 CAS 2022年第3期229-235,共7页

本文旨在为基因治疗产品研发者开展制品研发和生产等活动提供必要质量控制原则,适用于以病毒为载体的基因治疗制品,也适用于溶瘤病毒类制品。本文通过借鉴类似制品成熟的、有效的、实用性被证明的策略和方法阐述基因治疗制品质量控制生... 本文旨在为基因治疗产品研发者开展制品研发和生产等活动提供必要质量控制原则,适用于以病毒为载体的基因治疗制品,也适用于溶瘤病毒类制品。本文通过借鉴类似制品成熟的、有效的、实用性被证明的策略和方法阐述基因治疗制品质量控制生物通用技术要求,希望对整个行业的发展提供帮助。基因治疗制品制造和质量控制应依照风险评估、全过程控制和全生命周期管理理念,以保障制品质量为最终目的,并通过对各个制造环节的控制实现制品的低安全风险的稳定生产。 展开更多

关键词 基因治疗制品 病毒载体 生物制品生产 质量控制原则 通用技术要求

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重组腺相关病毒感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法的建立及验证

18

作者 裴德宁 闫书美 +3 位作者 史新昌 胡倩 周勇 刘宾 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第6期646-650,655,共6页

目的建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)感染细胞后目的蛋白表达水平的检测方法,并进行方法验证,以期用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。方法将rAAV9供试品用感染增强剂Envirus-AAV处理后,感染经... 目的建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)感染细胞后目的蛋白表达水平的检测方法,并进行方法验证,以期用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。方法将rAAV9供试品用感染增强剂Envirus-AAV处理后,感染经羟基脲(hydroxyurea,HU)作用的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87-MG,以rAAV9参考品为标准,采用ELISA法检测细胞中目的蛋白戊二酰辅酶A脱氢酶(glutaryl-CoA dehydrogenase,GCDH)的表达水平,并验证方法的专属性、准确性、精密性、线性范围、定量限及耐用性。采用建立的方法检测8批rAAV9供试品。结果供试品缓冲液的A_(450)-A_(630)为0.3,略低于蛋白定量四参数标准曲线最低稀释点(1 ng/mL);150%、100%、50%理论相对效价水平样品平均回收率均在100.0%~107.3%范围内;同1名实验员重复3次及不同实验员检测3个理论相对效价水平样品的目的蛋白表达水平RSD均<25%;rAAV9供试品在50%~150%理论相对效价水平范围内,与相应的目的蛋白表达水平呈良好的线性关系,直线回归方程为y=1.077 x-0.022,R~2为0.984;方法的定量限为0.59,即6.0×10^(12)vg/mL;U87-MG细胞用HU孵育不同时间(18、21、24 h)、细胞培养上清液于不同条件(室温放置0.5 h、-60℃以下放置12 h、-60℃以下放置24 h)保存后,目的蛋白表达水平RSD均<25%。1~8批rAAV9供试品目的蛋白表达水平分别为111%、121%、72%、65%、86%、75%、102%、91%。结论建立的rAAV感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。 展开更多

关键词 重组腺相关病毒 人脑星形胶质母细胞瘤细胞 目的蛋白 羟基脲 感染增强剂 酶联免疫吸附试验

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反相液相色谱-质谱联用技术对重组腺相关病毒6型衣壳蛋白的表征分析

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作者 郭莹 李响 +7 位作者 张拓 史新昌 何娟 聂爱英 裴德宁 周勇 秦玺 梁成罡 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第7期769-774,共6页

目的应用反相液相色谱-质谱(reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry,RPLC-MS)联用技术对重组腺相关病毒6型(recombinant adeno-associated virus 6,rAAV6)载体的衣壳蛋白进行表征分析,包括一级结构和翻译后修饰(post-... 目的应用反相液相色谱-质谱(reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry,RPLC-MS)联用技术对重组腺相关病毒6型(recombinant adeno-associated virus 6,rAAV6)载体的衣壳蛋白进行表征分析,包括一级结构和翻译后修饰(post-translational modification,PTM)。方法流动相A为0.1%二氟乙酸(difluoroacetic acid,DFA)的水溶液;流动相B为0.1%DFA的乙腈溶液;柱温:80℃;梯度洗脱10 min(0→10 min,流动相B 15%→45%)。ESI-Q-TOF质谱检测设为阳离子模式:质荷比扫描范围400~4000 m/z;扫描频率:2 Hz,锥孔电压:80 V;毛细管电压:3.0 kV;离子源温度:120℃。结果AAV衣壳蛋白VP1实测相对分子质量为81255.9,与理论值偏差为8.1 ppm;VP2蛋白实测相对分子质量为66062.9,与理论值偏差为3.8 ppm;VP3蛋白实测相对分子质量为59488.6,与理论值偏差为36 ppm。rAAV6酶切后质量肽图分析,样品序列覆盖率为89%,检测到的PTM主要包括脱酰胺、N-末端乙酰化、泛素化、磷酸化等,并未发现糖基化修饰位点。通过串联质谱分析确证了rAAV6衣壳蛋白N-末端和C-末端的序列以及N-末端的PTM。结论应用RPLC-MS联用技术分析了rAAV6衣壳蛋白的完整相对分子质量,并在肽段水平运用串联质谱深度分析了rAAV6衣壳蛋白的PTM,对AAV基因治疗制品的质量控制及生产工艺的提高具有一定意义。 展开更多

关键词 腺相关病毒 衣壳蛋白 反相液相色谱 串联质谱 相对分子质量 肽图

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促红素N-糖链的超高压液相色谱分析方法验证

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作者 李响 秦玺 +3 位作者 裴德宁 于雷 史新昌 周勇 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期598-604,共7页

目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证,为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后,进行2-AB衍生化标记,采用磁珠法纯化后进行液相分析,以pH 4.4的100 mmol·L^(-1)甲... 目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证,为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后,进行2-AB衍生化标记,采用磁珠法纯化后进行液相分析,以pH 4.4的100 mmol·L^(-1)甲酸铵溶液为流动相A液,70%乙腈为流动相B液,梯度洗脱70.0 min,荧光检测器检测,激发光波长260 nm、发射光波长430 nm。对该方法进行了相应的方法学验证。结果:考察了方法进样和制备重复性,峰簇1~5的峰面积百分比的RSD不高于4.08%,保留时间的RSD均不高于2.89%。方法中间精密度考察结果显示,峰簇1~5的峰面积百分比的RSD不高于11.85%,保留时间的RSD均不高于8.05%。方法准确度考察中,峰簇2,3,4相对峰面积回收率分别为98.28%~113.01%,98.68%~102.96%,98.51%~100.75%。在蛋白含量为2.5~7.5 mg·mL^(-1)(即促红素蛋白量50~150μg)时,峰簇1~5峰面积线性回归的决定系数均>0.99。设定方法定量限为蛋白量50μg,所制备的样品4℃放置48 h内稳定。结论:实验结果显示该方法的专属性、精密度、准确度和线性均良好,可为促红素N-糖质控方法的建立和验证提供参考。 展开更多

关键词 N-糖链 促红素 方法学验证 2-AB标记 质量控制

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