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广西鸡源肠炎沙门氏菌的分离与鉴定 被引量：1
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作者 邓显文 谢丽基 +4 位作者 谢芝勋 曾婷婷 华俊 何竞铭 卿崇程 《畜禽业》 2023年第1期10-13,共4页
对广西壮族自治区3个鸡场疑似沙门氏菌感染发病鸡进行细菌分离,并对分离菌株进行染色镜检、生化实验、血清学鉴定、DNA测序、动物回归试验和药敏试验。结果共分离到6株沙门氏菌,生化特征和血清学特征符合肠炎沙门氏菌特性;DNA测序结果... 对广西壮族自治区3个鸡场疑似沙门氏菌感染发病鸡进行细菌分离,并对分离菌株进行染色镜检、生化实验、血清学鉴定、DNA测序、动物回归试验和药敏试验。结果共分离到6株沙门氏菌,生化特征和血清学特征符合肠炎沙门氏菌特性;DNA测序结果与肠炎沙门氏菌同源性为100%;动物回归试验表明,分离菌株能致死SPF鸡,并复制出与临床表现一致的病例;药敏试验结果表明,分离菌株对诺氟沙星和阿米卡星高度敏感,为广西地区鸡源沙门氏菌病的防治提供参考依据。 展开更多
关键词 肠炎沙门氏菌 鸡 分离鉴定 药物敏感性
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血清4型禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
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作者 罗思思 邓显文 +7 位作者 谢芝勋 张艳芳 张民秀 谢志勤 谢丽基 李孟 王盛 李小凤 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期3092-3099,共8页
【目的】制备和鉴定血清4型禽腺病毒(FAdV-4)五邻体(penton)蛋白单克隆抗体,为深入探究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用及为抗原检测试剂研发提供抗体材料。【方法】以原核表达的FAdV-4 penton重组蛋白免疫6~8周雌性BALB/c小白... 【目的】制备和鉴定血清4型禽腺病毒(FAdV-4)五邻体(penton)蛋白单克隆抗体,为深入探究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用及为抗原检测试剂研发提供抗体材料。【方法】以原核表达的FAdV-4 penton重组蛋白免疫6~8周雌性BALB/c小白鼠,加强免疫3次后,取鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,通过penton-酶联免疫吸附剂测定(ELISA)和FAdV4 virus-ELISA方法分别筛选阳性杂交瘤细胞株,对筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚类鉴定、特异性和广谱性鉴定及间接免疫荧光和稳定性试验。【结果】亚类鉴定结果表明,筛选获得7株能稳定分泌抗FAdV-4 penton蛋白的杂交瘤细胞株(1D11、2B3、2C4、2C9、6B3、8F12和8G11),其轻链均为Kappa链,重链3株为IgG1,4株为IgG2b;特异性检测结果表明,7株单克隆抗体只与FAdV-4反应,不与其他11种血清型FAdV及NDV、ARV、EDSV和IBV等常见禽病病原体发生交叉反应;广谱性鉴定结果表明,7株单克隆抗体均可与19株FAdV-4分离株结合,广谱性好;间接免疫荧光试验结果表明,7株单克隆抗体均与感染FAdV-4的鸡胚肝细胞(CEL)结合,出现明亮的绿色荧光。对筛选出的3株单克隆抗体(6B3、8F12和8G11)进行稳定性检测,发现其稳定性良好。【结论】通过单克隆抗体制备和鉴定获得3株与FAdV-4蛋白结合效果较好并具有特异性和广谱性的FAdV-4 penton蛋白杂交瘤细胞株(6B3、8F12和8G11),能稳定分泌penton蛋白单克隆抗体,为深入研究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用提供单抗,为FAdV-4抗原检测试剂的研发打下基础。 展开更多
关键词 血清4型禽腺病毒 penton蛋白 单克隆抗体 杂交瘤细胞株
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二重荧光RT-LAMP鉴别检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体
3
作者 曾婷婷 谢芝勋 +9 位作者 谢丽基 王盛 谢志勤 黄娇玲 万丽军 任红玉 张艳芳 张民秀 范晴 邓显文 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第9期66-75,共10页
本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段,设计了2套LAMP引物,并各添加1条FD荧光探针,2条FD探针... 本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段,设计了2套LAMP引物,并各添加1条FD荧光探针,2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果:ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光,MS阳性对照发出绿色荧光,双重模板经过图像融合后为黄色荧光;特异性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原,对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应;敏感性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×10^(2)copies和1.9×10^(2)copies;使用该方法检测40份临床样品,检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上,该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果,为不同条件的实验室提供了新的检测手段。 展开更多
关键词 FD荧光探针 二重荧光RT-LAMP 禽呼肠孤病毒 鸡滑液囊支原体
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X蛋白(pX)在血清4型禽腺病毒感染LMH细胞后对Toll样受体的影响
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作者 李小凤 韦悠 +10 位作者 罗思思 谢志勤 阮志华 张民秀 黄娇玲 李丹 万丽军 李孟 任红玉 谢丽基 谢芝勋 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第12期2814-2821,共8页
【目的】研究X蛋白(Protein X,pX)在血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)感染LMH细胞后对Toll样受体产生的影响,为进一步阐释FAdV-4感染致病机制和免疫应答机理提供数据参考。【方法】通过PCR扩增X基因编码区序列,与pEF... 【目的】研究X蛋白(Protein X,pX)在血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)感染LMH细胞后对Toll样受体产生的影响,为进一步阐释FAdV-4感染致病机制和免疫应答机理提供数据参考。【方法】通过PCR扩增X基因编码区序列,与pEF1α-HA载体连接,构建重组表达质粒pEF1α-HA-X。将重组表达质粒pEF1α-HA-X和空质粒pEF1α-HA分别转染LMH细胞,24 h后用FAdV-4感染转染后的细胞,2个处理组分别标记为pEF1α-HA-X+和pEF1α-HA+;同时设立转染后未加病毒刺激组作对照,分别标记为pEF1α-HA-X-和pEF1α-HA-。用Western-blotting和间接免疫荧光验证重组蛋白表达情况,实时荧光定量PCR检测Toll样受体(chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a、chTLR2b、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21)和效应因子(IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-15)mRNA转录水平的变化。【结果】X基因开放阅读框(ORF)全长540 bp,共编码179个氨基酸残基。Western-blotting结果显示重组X蛋白与HA标签小鼠源单克隆抗体反应,在27 kD处得到单一条带,间接免疫荧光结果可见绿色荧光。实时荧光定量PCR检测发现,与pEF1α-HA-组相比较,pEF1α-HA-X-组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著上调(P<0.01,下同),分别为pEF1α-HA-组的9.76和12.34倍;chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA转录水平显著上调(P<0.05,下同)。添加病毒感染后,与pEF1α-HA-X-组相比,pEF1α-HA-X+组chTLR1a和chTLR1b的mRNA转录水平极显著下调,分别下调60.0%和66.7%;chTLR2a、chTLR2b和chTLR3的mRNA转录水平显著提高,分别显著上调2.91、2.01和1.47倍,其他chTLRs的mRNA转录水平下调,但差异不显著(P>0.05);同时,pEF1α-HA-X+组效应因子IFN-α、IFN-β、IL-1β的mRNA转录水平比pEF1α-HA-X-组显著上调,IL-8的mRNA转录水平极显著下调。【结论】在LMH细胞过表达pX并被FAdV-4感染后,pX能激活宿主免疫应答系统,Toll样受体(chTLR2a、chTLR2b和chTLR3)和其效应因子(IFN-α、IFN-β和IL-1β)的mRNA转录水平显著上调以抑制病毒复制,说明pX具备激活宿主细胞天然免疫系统的功能。 展开更多
关键词 FAdV-4 PX TOLL样受体 效应因子 实时荧光定量PCR
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鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立
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作者 谢志勤 谢芝勋 +14 位作者 张艳芳 范晴 谢丽基 万丽军 罗思思 李孟 张民秀 曾婷婷 黄娇玲 王盛 李丹 韦悠 李小凤 任红玉 阮志华 《西北农业学报》 CAS CSCD 2024年第3期381-388,共8页
旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR... 旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。 展开更多
关键词 鸡传染性喉气管炎病毒 微滴式数字PCR 定量检测
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4株不同基因型新城疫病毒毒力测定及与商品疫苗株抗原性比较
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作者 黄青红 华俊 +6 位作者 谢丽基 谢芝勋 曾婷婷 李孟 罗思思 李丹 谢志勤 《动物医学进展》 2024年第2期16-21,共6页
为了探究不同基因型和不同来源4株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)及现有商品疫苗株的抗原性差异,测定4株新城疫病毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间(mean death time,MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogen... 为了探究不同基因型和不同来源4株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)及现有商品疫苗株的抗原性差异,测定4株新城疫病毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间(mean death time,MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI),分别制备油乳苗,再与商品疫苗NDV La Sota株、A-Ⅶ株分别接种SPF鸡,收集单因子血清进行HI交叉试验和细胞交叉中和试验。结果显示,基因Ⅵ型NDV B27为中等毒力毒株,基因Ⅶ型NDV B9、基因Ⅸ型NDV B14、基因Ⅻ型NDV GX01为强毒株;HI交叉试验结果显示,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14抗原同源性为0.64,抗原性差异微小,其他毒株之间的抗原同源性为0.69~0.99,抗原差异不大;细胞交叉中和试验结果显示,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14抗原同源性为0.42,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅱ型疫苗株La Sota抗原同源性为0.47,抗原差异较大,其余毒株及疫苗株La Sota之间抗原差异微小。试验结果可为后续筛选NDV疫苗候选株提供参考。 展开更多
关键词 新城疫病毒 基因型 抗原性 致病指数
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广西鸭源H3N8亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析
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作者 李孟 李丹 +8 位作者 谢芝勋 罗思思 张民秀 谢丽基 华俊 粟永春 翟国胜 黄娇玲 陈智武 《安徽农业科学》 CAS 2024年第1期72-77,共6页
[目的]了解广西水禽中分离到的H3N8亚型禽流感病毒的分子遗传进化特征。[方法]将从活禽市场采集的水禽棉拭子样品经处理后接种SPF鸡胚,应用血凝试验和血凝抑制试验对收取尿囊液进行血清学鉴定,然后对分离到的禽流感病毒进行全基因序列... [目的]了解广西水禽中分离到的H3N8亚型禽流感病毒的分子遗传进化特征。[方法]将从活禽市场采集的水禽棉拭子样品经处理后接种SPF鸡胚,应用血凝试验和血凝抑制试验对收取尿囊液进行血清学鉴定,然后对分离到的禽流感病毒进行全基因序列测定和遗传进化分析。[结果]血清学及HA和NA基因测序结果显示,该分离毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/duck/Guangxi/446D28/2021(H3N8)。全基因遗传进化分析显示,其HA蛋白无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;NA蛋白出现耐药性氨基酸位点突变;该毒株8个基因片段在GenBank中比对分析结果显示,其同源性最高的毒株基本主要来自越南和位于我国候鸟迁徙路线上的宁夏及江西等省(区)。[结论]该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过相互基因交换所形成的基因重组体。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H3N8 水禽 基因重组
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血清4型禽腺病毒Ⅷ蛋白真核表达及其对LMH细胞天然免疫相关基因的影响
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作者 李小凤 阮志华 +6 位作者 石勇丽 武晓倩 韦悠 万丽军 谢志勤 任红玉 谢芝勋 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第4期861-867,共7页
【目的】分析血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Ⅷ蛋白(ProteinⅧ,pⅧ)对宿主天然免疫相关基因表达的影响,为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列,与pEF1α-HA载体连接,构建重组表达质粒pEF1α-... 【目的】分析血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Ⅷ蛋白(ProteinⅧ,pⅧ)对宿主天然免疫相关基因表达的影响,为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列,与pEF1α-HA载体连接,构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒(试验组)和pEF1α-HA空质粒(对照组)转染LMH细胞,利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况,实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-κB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框(ORF)全长744 bp,共编码247个氨基酸残基,真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应,在34 kD处得到单一条带;间接免疫荧光检测可见绿色荧光,说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比,Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后,模式受体STING基因的表达水平显著提高5.6倍(P<0.05,下同),MDA5基因的表达水平提高30%;接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高1.5和2.4倍;转录因子IRF7的表达水平显著提高3.4倍,而NF-κB基因被抑制表达。同时,干扰素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β)的表达水平均上调,IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍(P<0.01),而IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β分别显著上调4.1、2.1、6.0和7.9倍。【结论】在LMH细胞中过表达FAdV-4 pⅧ,STING、MDA5、TBK1、MAVS、IRF7、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β等天然免疫相关基因呈上调表达,表明Ⅷ蛋白对FAdV-4激发宿主的天然免疫具有一定促进作用。 展开更多
关键词 FAdV-4 Ⅷ蛋白 真核表达 天然免疫因子 实时荧光定量PCR
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应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的研究 被引量：25
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作者 谢芝勋 谢志勤 +2 位作者 庞耀珊 刘加波 邓显文 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 2000年第6期443-446,共4页
本文建立了一种同时检测NDV、IBV、ILTV和MG 4种病原体的多重PCR技术。根据NDV、IBV、ILTV和MG的基因文库 ,设计了 4对分别与NDV、IBV、ILTV和MG某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV、MGRVA或DNA模板进... 本文建立了一种同时检测NDV、IBV、ILTV和MG 4种病原体的多重PCR技术。根据NDV、IBV、ILTV和MG的基因文库 ,设计了 4对分别与NDV、IBV、ILTV和MG某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV、MGRVA或DNA模板进行多重PCR扩增 ,结果均同时得到了 4条特异性大小与实验设计相符的 310bp(NDV)、172 0bp(IBV)、6 47bp(ILTV)、和 732bp(MG)多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重PCR技术能检出 10pg的IBV、1pg的NDVRNA模板和 10pg的ILTV、1pg的MGDNA模板。 展开更多
关键词 多重聚合酶链式反应 检测 鸡新城疫病毒 鸡传染性支气管炎病毒 鸡传染性喉气管炎病毒 鸡毒支原体
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禽呼肠孤病毒广西分离株σ_3基因的克隆和表达 被引量：18
10
作者 谢芝勋 邓显文 +3 位作者 刘加波 庞耀珊 唐小飞 廖敏 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期167-170,共4页
采用RT_PCR技术扩增禽呼肠孤病毒广西分离株R1σ3基因,将σ3基因克隆至PGEX_4T_1载体上,测序结果表明插入的片段为σ3目的基因。切下目的基因σ3,重组到含有谷胱甘肽(GST)的融合蛋白质粒表达载体PGEX_4T_1,获得重组质粒经PCR酶切以及序... 采用RT_PCR技术扩增禽呼肠孤病毒广西分离株R1σ3基因,将σ3基因克隆至PGEX_4T_1载体上,测序结果表明插入的片段为σ3目的基因。切下目的基因σ3,重组到含有谷胱甘肽(GST)的融合蛋白质粒表达载体PGEX_4T_1,获得重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定,表达σ3基因插入的位置,大小和阅码框架均正确,表明成功构建了融合表达载体PGEX_R1_σ3。构建好的重组质粒,经1mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌DH5α中得到了表达。融合蛋白GST_R1_σ3的分子量为60ku,以包涵体形式存在。Westernblot分析表明,融合蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 σ3基因 基因克隆 基因表达 PGEX-4T-1 广西分离株 RT-PCR
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二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用 被引量：19
11
作者 谢芝勋 庞耀珊 +2 位作者 刘加波 邓显文 唐小飞 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期9-12,24,共5页
建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV(AF369029)和IHHNV(NC002190)基因序列,设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物,用这两对引... 建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV(AF369029)和IHHNV(NC002190)基因序列,设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物,用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板进行多重PCR扩增,结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)特异性多重PCR扩增条带,而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNV DNA各100 pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测,结果230份检出WSSV,阳性率57.5%;96份检出IHHNV,阳性率24%;56份同时检出WSSV和IHHNV,阳性率14%。18份为阴性,阴性率为4.5%。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中,作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。 展开更多
关键词 多重聚合酶链式反应 检测 对虾 白斑综合征病毒(WSSV) 传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)
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多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用 被引量：15
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作者 谢芝勋 庞耀珊 +2 位作者 邓显文 唐小飞 刘加波 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期393-396,共4页
根据基因库中对虾桃拉综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(I-HHNV)的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT-PCR。... 根据基因库中对虾桃拉综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(I-HHNV)的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT-PCR。该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp(TSV)、593bp(WSSV)和356bp(IHHNV)的特异性多重RT-PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pg TSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I-HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。 展开更多
关键词 多重聚合酶链式反应 对虾 桃拉综合征病毒 白斑综合征病毒 传染性皮下和造血器官坏死病毒
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禽呼肠孤病毒地高辛探针的制备及应用 被引量：16
13
作者 谢芝勋 廖敏 +4 位作者 刘加波 邓显文 庞耀珊 谢志勤 唐小飞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期407-410,共4页
从带有禽呼肠孤病毒 (ARV)S1cDNA片段的重组质粒中回收 5 4 0bpS1cDNA片段 ,并制备出地高辛标记的ARVcD NA探针。其特异性检测结果表明 ,该探针能与ARV不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应 ,而与对照IBV、NDV、ILTV、MG、E .coli正常鸡... 从带有禽呼肠孤病毒 (ARV)S1cDNA片段的重组质粒中回收 5 4 0bpS1cDNA片段 ,并制备出地高辛标记的ARVcD NA探针。其特异性检测结果表明 ,该探针能与ARV不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应 ,而与对照IBV、NDV、ILTV、MG、E .coli正常鸡胚尿囊液抽提的核酸及载体PBluescript空质粒DNA的杂交反应均为阴性 ,敏感性检测结果表明 ,该探针对ARVRNA的最低检出量为 0 .4 5ng。应用该探针对不同方法处理的病料进行检测 ,结果均出现杂交显色反应。 展开更多
关键词 禽 呼肠孤病毒 地高辛探针 制备 应用
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应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒 被引量：11
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作者 谢芝勋 庞耀珊 +6 位作者 何竞铭 邓显文 唐小飞 刘加波 谢志勤 廖敏 文雪 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期13-15,共3页
研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒 (WSSV)和桃拉病毒 (TSV)的多重聚合酶链式反应 (多重PCR)技术。根据 WSSV和 TSV基因序列 ,设计合成了 2对分别与 WSSV和 TSV某段基因序列互补的引物 ,用这 2对引物对同一样品中的 WSSV DNA... 研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒 (WSSV)和桃拉病毒 (TSV)的多重聚合酶链式反应 (多重PCR)技术。根据 WSSV和 TSV基因序列 ,设计合成了 2对分别与 WSSV和 TSV某段基因序列互补的引物 ,用这 2对引物对同一样品中的 WSSV DNA和 TSV RNA模板进行多重 PCR扩增 ,结果均同时得到了 2条特异的与实验设计相符的 30 6 bp(WSSV)和 2 31bp(TSV)多重 PCR扩增带 ,而对其他对虾病病原的 PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重 PCR技术能检出 10 pg的 WSSV DNA和 1pg的 TSV 展开更多
关键词 WSSV 桃拉病 对虾白斑综合征病毒 引物 多重聚合酶 虾病 多重PCR检测 扩增 鉴别 RNA
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结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测 被引量：15
15
作者 谢芝勋 谢志勤 +5 位作者 雷剑明 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢丽基 温娟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1141-1144,共4页
目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分... 目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。 展开更多
关键词 检测 结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 二重PCR
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禽呼肠孤病毒S1基因的扩增克隆与鉴定 被引量：17
16
作者 谢芝勋 廖敏 +4 位作者 庞耀珊 谢志勤 邓显文 刘加波 李康然 《中国兽医科技》 CAS CSCD 2000年第8期3-5,共3页
利用反转录 聚合酶链 (RT PCR)技术 ,扩增出禽呼肠孤病毒 (ARV )S113 3、173 3长为 5 40bp的S1基因片段。将扩增到的这 2个毒株的S1基因通过粘端连接分别克隆到pBluescriptⅡKS +质粒中 ,用PCR和限制性内切酶分析鉴定 ,表明获得 2种重... 利用反转录 聚合酶链 (RT PCR)技术 ,扩增出禽呼肠孤病毒 (ARV )S113 3、173 3长为 5 40bp的S1基因片段。将扩增到的这 2个毒株的S1基因通过粘端连接分别克隆到pBluescriptⅡKS +质粒中 ,用PCR和限制性内切酶分析鉴定 ,表明获得 2种重组质粒ARVS113 3S1 pBluescript、ARV 173 3S1 pBluescript。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 RT-PCR S1基因 克隆
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多重PCR快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的研究与应用 被引量：19
17
作者 谢芝勋 谢志勤 +4 位作者 刘加波 庞耀珊 邓显文 唐小飞 温娟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期714-717,737,共5页
目的利用多重PCR方法建立一种同时快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的方法。方法根据牛布鲁氏菌具有种特异性的BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23SrRNA,设计并合成了两对分别扩增牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的特异性引物,建立了多重PCR同时快... 目的利用多重PCR方法建立一种同时快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的方法。方法根据牛布鲁氏菌具有种特异性的BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23SrRNA,设计并合成了两对分别扩增牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的特异性引物,建立了多重PCR同时快速检测鉴别以上两种病原体的方法。其扩增片段大小牛布鲁氏菌为311bp、牛分枝杆菌为838bp。对所建立的多重PCR方法进行特异性试验和敏感性试验。并应用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该多重PCR方法对所有供试的牛布鲁氏菌都能扩增出311bp,结核分枝杆菌都能扩增出838bp目的片段,对其它参试牛的菌株则无311bp和838bp条带,该多重PCR方法对牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量为10pg。305份临床样品中10份牛奶样品为牛布鲁氏菌阳性,41份包括36份PPD阳性鼻粘液样品、3份PPD可疑鼻粘液样品和2份PPD阳性牛奶样品为牛分枝杆菌阳性,其余样品均为阴性。 展开更多
关键词 多重PCR 牛布鲁氏菌 牛分枝杆菌
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用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究 被引量：14
18
作者 谢芝勋 庞耀珊 +2 位作者 刘加波 邓显文 谢志勤 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第5期365-367,共3页
本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法，根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列，设计合成两对引物，用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进... 本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法，根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列，设计合成两对引物，用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进行了检测。结果两对引物对 ６ 株 Ａ Ｒ Ｖ 均可扩增出与预期大小相符 ５３２ｂｐ 和 ４３５ｂｐ 的 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 产物，而对其它 ６ 种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性；该 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 可以检测出 １ｐｇ 的 Ａ Ｒ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 模板。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 引物 ARV RT-PCR
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多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究 被引量：12
19
作者 谢芝勋 邓显文 +5 位作者 谢志勤 庞耀珊 唐小飞 廖敏 刘加波 何竞铭 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期476-479,共4页
根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点 ,设计合成了二对引物XZ1,XZ2 和XZ45、XZ46,建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明 ,用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗株进行多重PCR ,强毒株只... 根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点 ,设计合成了二对引物XZ1,XZ2 和XZ45、XZ46,建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明 ,用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗株进行多重PCR ,强毒株只扩增出 732bp一条带 ,而弱毒疫苗株则可同时扩增出 732bp、5 2 4bp二条带 ,而对其他种类鸡支原体和其它禽病病原的扩增不出现任何条带 ,结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重PCR最低能检出 1pg的MG强毒株和弱毒疫苗株的DNA模板。 展开更多
关键词 多重PCR 检测鉴别 鸡毒支原体 强毒株、弱毒株
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应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡3种病毒性呼吸道传染病的研究 被引量：36
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作者 谢芝勋 谢志勤 +3 位作者 庞耀珊 刘加波 邓显文 廖敏 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2001年第1期11-14,共4页
根据鸡新城疫病毒 (NDV )、鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)和鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV)的基因文库 ,设计了3对分别与NDV、IBV和ILTV某段基因序列互补的引物。用这 3对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV核酸模板进行三重PCR扩增 ,结果均... 根据鸡新城疫病毒 (NDV )、鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)和鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV)的基因文库 ,设计了3对分别与NDV、IBV和ILTV某段基因序列互补的引物。用这 3对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV核酸模板进行三重PCR扩增 ,结果均同时得到了 3条与设计相符的 310bp(NDV)、172 0bp(IBV)和 6 47bp(ILTV)三重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该三重PCR技术能检出 10 pg的IBV、1pg的NDVRNA模板和 10 pg的ILTVDNA模板。 展开更多
关键词 三重聚合酶链反应 鸡新城疫病毒 鸡传染性支气管炎病毒 传染性喉气管炎病毒
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