环丙沙星单克隆抗体的制备

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作者 贾杰只 陈晓丹 +1 位作者 雷洁 张智英 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第9期35-40,共6页

【目的】制备环丙沙星(Crprofloxacin,CPFX)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),并对其免疫学特性进行鉴定,为畜产品CPFX残留的快速检测提供技术支持。【方法】采用碳二亚胺法(EDC),将载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA... 【目的】制备环丙沙星(Crprofloxacin,CPFX)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),并对其免疫学特性进行鉴定,为畜产品CPFX残留的快速检测提供技术支持。【方法】采用碳二亚胺法(EDC),将载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)分别与CPFX偶联合成免疫抗原CPFX-BSA和包被抗原CPFX-OVA,经紫外(UV)扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术筛选分泌CPFX mAb的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备CPFX mAb,并对其染色体核型、效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】UV和SDS-PAGE鉴定结果表明,人工抗原偶联成功;免疫的5只小鼠血清抗体效价均达到了1∶105左右,其中4号小鼠血清CPFX抑制效价较高且IC50最低(17.21μg/L),融合后筛选出1株敏感特异的杂交瘤细胞,命名为3D2。3D2细胞培养上清效价为1∶(1.28×103),腹水效价为1∶(1.6×105)。CPFX mAb对CPFX的IC50为9.95μg/L,对恩诺沙星的交叉反应率为128.39%,与其他同系的喹诺酮类抗生素的交叉反应率很低。【结论】获得了高效价、敏感、特异的抗CPFX mAb,为CPFX残留的快速检测奠定了技术基础。 展开更多

关键词 环丙沙星 单克隆抗体 ELISA 杂交瘤

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大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体液泡型腺苷三磷酸酶活性变化对心肌损害的影响及其机制 被引量：5

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作者 闫雪萍 张东霞 +3 位作者 闫甜甜 张琼 贾杰只 黄跃生 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期295-300,共6页

目的探讨大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体液泡型ATP（V－ATP）酶活性变化对心肌损害的影响及其机制。方法取12只SD大鼠心脏，采用超高速梯度密度离心法提取心肌组织溶酶体，蛋白质印迹法和透射电镜观察鉴定。将120只SD大鼠按随机数字表法... 目的探讨大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体液泡型ATP（V－ATP）酶活性变化对心肌损害的影响及其机制。方法取12只SD大鼠心脏，采用超高速梯度密度离心法提取心肌组织溶酶体，蛋白质印迹法和透射电镜观察鉴定。将120只SD大鼠按随机数字表法分为单纯烧伤组、ATP组、正常对照组、巴佛洛霉素组，每组30只。单纯烧伤组和ATP组大鼠造成背部约40%TBSA Ⅲ度烫伤，单纯烧伤组大鼠伤后即刻腹腔注射乳酸林格液4 mL·%TBSA^－1·kg^－1，ATP组大鼠分别于伤前12 h、伤后即刻、伤后12 h腹腔注射ATP 0.4 mg/kg。正常对照组大鼠不行任何处理，巴佛洛霉素组与ATP组大鼠同时相点腹腔注射巴佛洛霉素A1 0.3 mg/kg。于伤后24 h，提取各组大鼠心肌组织溶酶体，采用酶偶联分析法检测V－ATP酶活性，蛋白质印迹法检测心肌自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）和P62的表达。取左心室动脉血检测心肌酶谱5项和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的含量。对数据行单因素方差分析、t检验。结果（1）经鉴定，样品溶酶体相关膜蛋白1表达水平最高，溶酶体纯度高、结构完整。（2）伤后24 h，单纯烧伤组、ATP组、正常对照组、巴佛洛霉素组大鼠心肌组织溶酶体V－ATP酶活性分别为（2.03±0.67）、（3.01±0.58）、（4.29±0.26）、（1.83±0.52）μmol·mg－1·h－1。其中单纯烧伤组大鼠心肌组织溶酶体V－ATP酶活性明显低于ATP组和正常对照组（t值分别为3.14和8.87，P值均小于0.01），正常对照组大鼠心肌组织溶酶体V－ATP酶活性明显高于巴佛洛霉素组（t＝11.87，P〈0.01）。伤后24 h，单纯烧伤组大鼠心肌LC3和P62的表达显著高于ATP组和正常对照组（t值为3.73～5.88，P值均小于0.01），正常对照组大鼠心肌LC3和P62的表达明显低于巴佛洛霉素组（t值分别为2.64和3.07，P〈0.05或P〈0.01）。伤后24 h，单纯烧伤组大鼠心肌酶谱5项和cTnT含量明显高于ATP组和正常对照组（t值为3.24～16.72，P值均小于0.01），正常对照组大鼠心肌酶谱5项和cTnT含量明显低于巴佛洛霉素组（t值为2.39～10.70，P值均小于0.01）。结论大鼠严重烧伤后心肌组织溶酶体V－ATP酶活性下降，可通过抑制大鼠心肌自噬流引起心肌损害。 展开更多

关键词 烧伤 心肌 自噬 溶酶体 液泡型腺苷三磷酸酶

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雷帕霉素对人表皮细胞株HaCaT迁移的影响及其分子机制 被引量：2

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作者 张均辉 张东霞 +4 位作者 赵利平 闫甜甜 张琼 贾杰只 黄跃生 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期40-45,共6页

目的探讨雷帕霉素对人表皮细胞株HaCaT迁移的影响，并初步分析其分子机制。方法采用含体积分数10％FBS的RPMI1640培养液（简称培养液）常规培养HaCaT细胞。（1）取对数生长期细胞，按照随机数字表法将其分为对照组及1、5、50、100、200n... 目的探讨雷帕霉素对人表皮细胞株HaCaT迁移的影响，并初步分析其分子机制。方法采用含体积分数10％FBS的RPMI1640培养液（简称培养液）常规培养HaCaT细胞。（1）取对数生长期细胞，按照随机数字表法将其分为对照组及1、5、50、100、200nmol／L雷帕霉素组，每组6孔。5个雷帕霉素组细胞分别加入含相应质量浓度雷帕霉素的培养液，对照组细胞加入含二甲基亚砜（DMSO）的培养液。常规培养4h后，采用酶标仪检测细胞增殖活性（以吸光度值表示）。（2）取对数生长期细胞，同实验（1）分组培养，每组l孑L。常规培养4h后，在活细胞工作站下观察各组细胞3h内运动范围，计算细胞曲线运动速度，筛选雷帕霉素适宜实验浓度。（3）取对数生长期细胞，按随机数字表法将其分为雷帕霉素组和对照组，每组1孔。雷帕霉素组细胞加入含50nmol／L雷帕霉素的培养液，对照组细胞加入含DMSO的培养液。常规培养4h后行划痕实验，观察划痕后0（即刻）、5、10、15h的划痕面积并计算后3个时相点的细胞迁移率。（4）取对数生长期细胞，同实验（3）分组培养，每组1孔。用蛋白质印迹法检测细胞黏着斑激酶（FAK）活性（以磷酸化FAK与FAK灰度值比值表示）。上述实验重复3次或5次。对数据行单因素方差分析、LSD检验、t检验。结果（1）对照组及1、5、50、100、200nmol／L雷帕霉素组细胞增殖活性分别为1．22±0．28、1．29±0．38、1．12±0．27、1．20±0．29、1．15±0．30、1．39±0．40，组间比较差异无统计学意义（F=2．112，P=0．068）。（2）1、5nmol／L雷帕霉素组细胞的运动范围与对照组接近，其余3个雷帕霉素组细胞的运动范围明显小于对照组。组间细胞曲线运动速度总体比较，差异有统计学意义（F=3．525，P=0．004）。l、5nmol／L雷帕霉素组细胞曲线运动速度分别为（0．8±0．4）、（0．8±0．8）μm／min，与对照组[（0．9±0．5）μm／min]相近（P值均大于0．05）；50、100、200nmol／L雷帕霉素组细胞曲线运动速度分别为（0．7±0．5）、（0．7±0．4）、（0．7±0．4）μm／min，明显慢于对照组（P值均小于0．01）。选择50nmol／L雷帕霉素用于后续实验。（3）划痕后0、5h，雷帕霉素组细胞划痕面积与对照组相近；划痕后10、15h，雷帕霉素组细胞划痕面积较对照组大。划痕后5h，对照组及雷帕霉素组的细胞迁移率分别为（17．5±2．6）％、（15．8±3．5）％，组间比较差异无统计学意义（t=1．951，P〉0．05）。雷帕霉素组划痕后10、15h的细胞迁移率分别为（42．5±4．0）％、（71．3±9．2）％，明显低于对照组的（46．9±6．7）％、（88．0±7．7）％，t值分别为2．732、6．746，P值均小于0．01。（4）雷帕霉素组细胞FAK活性为O．16±0．08，明显低于对照组的0．46±0．14，t=4．967，P〈0．01。结论在HaCaT细胞中，FAK信号通路对雷帕霉素敏感，FAK活性下降可能参与介导雷帕霉素对HaCaT细胞迁移的抑制效应。 展开更多

关键词 西罗莫司 细胞增殖 细胞迁移分析 细胞运动 黏着斑激酶 HACAT细胞

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载P311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响 被引量：4

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作者 张清荣 陈长友 +6 位作者 徐娜 吕大伦 贾杰只 李文红 罗高兴 于云龙 张逸 《中华烧伤与创面修复杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期914-922,共9页

目的探讨载P311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法采用实验研究方法。通过油包水乳化法制备聚乙烯醇/海藻酸钠微球(单纯微球)、P311微球及异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)微球,于光学显微镜/... 目的探讨载P311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法采用实验研究方法。通过油包水乳化法制备聚乙烯醇/海藻酸钠微球(单纯微球)、P311微球及异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)微球,于光学显微镜/倒置荧光显微镜下观察形貌。制备壳聚糖溶液,将壳聚糖溶液和β-磷酸甘油二钠水合物混合制备单纯温敏水凝胶,在单纯温敏水凝胶中加入相应物质制备载单纯微球和载P311微球的温敏水凝胶,观察4种液体在37℃时倾斜状态下的形态变化,冷冻干燥后于扫描电子显微镜下观察微观形貌。取18只3~4周龄雄性SD大鼠,分为不进行任何处理的正常组及于背部脊柱两侧分别制作1个全层皮肤缺损创面并进行相应处理的敷贴组、壳聚糖组、单纯水凝胶组、载单纯微球水凝胶组、载P311微球水凝胶组,每组3只。取5组全层皮肤缺损大鼠,于伤后0(即刻)、5、10、15 d观察创面愈合情况,计算伤后5、10、15 d创面愈合率;取5组全层皮肤缺损大鼠伤后15 d创面和创缘组织及正常组大鼠相同部位正常皮肤组织,行苏木精-伊红染色观察组织学变化,行免疫组织化学染色观测CD31及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,采用蛋白质印迹法检测CD31及VEGF的蛋白表达。样本数均为3。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析及Bonferroni校正。结果单纯微球呈球形,表面疏松多孔;P311微球及FITC-BSA微球表面光滑无孔隙,且FITC-BSA微球散发出均匀的绿色荧光;3种微球直径基本一致,为33.1~37.7μm。在37℃时倾斜状态下,与壳聚糖溶液及单纯温敏水凝胶相比,载微球的2种水凝胶结构更稳定。载微球的2种水凝胶网状结构较壳聚糖溶液、单纯温敏水凝胶更致密,且其横断面可见直径约30μm的微球。伤后15 d内,5组大鼠创面均不同程度愈合,其中载P311微球水凝胶组大鼠创面愈合情况最好。敷贴组、壳聚糖组大鼠伤后5、10、15 d创面愈合率分别为(26.6±2.4)%、(38.5±3.1)%、(50.9±1.5)%,(47.6±2.0)%、(58.5±3.6)%、(66.7±4.1)%,均明显低于载P311微球水凝胶组的(59.3±4.8)%、(87.6±3.2)%、(97.2±1.0)%,P<0.05或P<0.01;单纯水凝胶组大鼠伤后10、15 d及载单纯微球水凝胶组大鼠伤后15 d创面愈合率分别为(76.0±3.3)%、(84.5±3.6)%、(88.0±2.6)%,均明显低于载P311微球水凝胶组(P<0.05)。正常组大鼠正常皮肤中可见表皮、毛囊及皮脂腺,未见CD31和VEGF阳性表达;载P311微球水凝胶组大鼠伤后15 d创面已几乎完全上皮化,创面血管、毛囊、皮脂腺生成及CD31和VEGF阳性表达较其他4组全层皮肤缺损大鼠明显增加,CD31和VEGF蛋白表达均较其余5组大鼠明显增加(P<0.01)。结论载P311微球的温敏壳聚糖水凝胶,可以缓释包载的药物,延长药物作用时间,并通过促进创面血管生成及再上皮化,促进全层皮肤缺损大鼠创面愈合。 展开更多

关键词 生物相容性材料 水凝胶 微球体 P311 血管生成 创面修复

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活性氧响应性抗菌微针对糖尿病小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面的影响 被引量：2

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作者 张清荣 杨晓 +4 位作者 李正 贾杰只 罗高兴 于云龙 张逸 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期1024-1035,共12页

目的研究活性氧响应性抗菌微针对糖尿病小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面的影响。方法采用实验研究方法。合成活性氧响应性交联剂N1-(4-溴苄基)-N3-(4-溴苯基)-N1,N1,N3,N3-四甲基丙烷-1,3-二胺(TSPBA),混合相应成分制成聚乙烯醇-TSPBA(PVA... 目的研究活性氧响应性抗菌微针对糖尿病小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面的影响。方法采用实验研究方法。合成活性氧响应性交联剂N1-(4-溴苄基)-N3-(4-溴苯基)-N1,N1,N3,N3-四甲基丙烷-1,3-二胺(TSPBA),混合相应成分制成聚乙烯醇-TSPBA(PVA-TSPBA)微针、PVA-ε-聚赖氨酸(ε-PL)-TSPBA微针、PVA-TSPBA-透明质酸钠(SH)微针、PVA-ε-PL-TSPBA-SH微针。将PVA-TSPBA微针分别置于单纯磷酸盐缓冲液(PBS)和含过氧化氢的PBS中,观察浸泡0(即刻)、3、7、10 d微针降解情况,表示其活性氧响应性。将用含过氧化氢的LB培养基培养的金黄色葡萄球菌标准菌株与大肠埃希菌标准菌株各自按随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组(不行任何处理,下同)以及与含相应浓度ε-PL的PVA-ε-PL-TSPBA微针共培养的0 g/Lε-PL组、1.0 g/Lε-PL组、5.0 g/Lε-PL组、10.0 g/Lε-PL组,培养24 h,观察细菌生长情况并计算细菌相对存活率(样本数为3)。将对数生长期的小鼠成纤维细胞系3T3细胞(生长周期下同)分为空白对照组以及用含相应浓度ε-PL的PVA-ε-PL-TSPBA微针浸提液培养的0 g/Lε-PL组、1.0 g/Lε-PL组、5.0 g/Lε-PL组、10.0 g/Lε-PL组,培养24 h,用光学显微镜观察细胞生长情况,用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测并计算细胞相对存活率(以此表示细胞毒性,样本数为6)。取PVA-TSPBA微针与PVA-TSPBA-SH微针,用光学显微镜观察2种微针形貌,用微机控制电子万能试验机检测2种微针机械性能(以临界力表示,样本数为6)。取6只6~8周龄雄性BALB/c小鼠(性别、鼠龄下同),分为PVA-TSPBA组与PVA-TSPBA-SH组(每组3只),用相应微针垂直按压背部皮肤1 min后,观察按压完成后0、10、20 min皮肤情况。另取3T3细胞,分为空白对照组,用含相应浓度ε-PL的PVA-ε-PL-TSPBA微针浸提液培养的0 g/Lε-PL组、单纯5.0 g/Lε-PL组,用含5.0 g/Lε-PL的PVA-ε-PL-TSPBA-SH微针浸提液培养的5.0 g/Lε-PL+SH组,CCK-8法检测并计算培养24、48、72 h细胞相对存活率,以此表示细胞增殖活性(样本数为6)。取18只BALB/c小鼠,通过高糖高脂饮食联合链脲佐菌素注射诱导为糖尿病小鼠模型后,分为无菌敷贴组、0 g/Lε-PL+SH组与5.0 g/Lε-PL+SH组(每组6只),在每只小鼠背部制作全层皮肤缺损创面后滴加金黄色葡萄球菌溶液,制成糖尿病小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面模型,0 g/Lε-PL+SH组、5.0 g/Lε-PL+SH组小鼠创面覆盖含相应浓度ε-PL的PVA-ε-PL-TSPBA-SH微针后,3组小鼠创面均外覆无菌手术敷贴。于伤后0、3、7、12 d观察创面愈合情况,计算伤后3、7、12 d创面愈合率;伤后12 d,取创面及创缘皮肤组织行苏木精-伊红染色,观察新生上皮生长及炎症细胞浸润情况。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、Mann-WhitneyU检验、Bonferroni法。结果随着浸泡时间的延长,置于含过氧化氢PBS中的PVA-TSPBA微针逐渐溶解并于浸泡10 d完全降解,置于单纯PBS中的PVA-TSPBA微针仅发生溶胀而未溶解。培养24 h,5.0 g/Lε-PL组、10.0 g/Lε-PL组金黄色葡萄球菌未见生长,10.0 g/Lε-PL组大肠埃希菌未见生长;1.0 g/Lε-PL组、5.0 g/Lε-PL组、10.0 g/Lε-PL组金黄色葡萄球菌相对存活率较空白对照组明显降低(P<0.05或P<0.01),5.0 g/Lε-PL组、10.0 g/Lε-PL组大肠埃希菌相对存活率较空白对照组明显降低(P<0.01)。培养24 h,空白对照组、0 g/Lε-PL组、1.0 g/Lε-PL组、5.0 g/Lε-PL组、10.0 g/Lε-PL组细胞生长状态良好,组间细胞相对存活率相近(P>0.05)。PVA-TSPBA微针与PVA-TSPBA-SH微针的针体均呈四棱锥形,排列整齐,其中PVA-TSPBA-SH微针的针体更立体、棱角更分明。PVA-TSPBA-SH微针的临界力明显高于PVA-TSPBA微针(Z=3.317,P<0.01)。PVA-TSPBA-SH组小鼠按压完成后0 min微针穿透皮肤,10 min后针孔部分消失,20 min后针孔完全消失;PVA-TSPBA组微针未能穿透小鼠皮肤。培养24、48、72 h,5.0 g/Lε-PL+SH组细胞增殖活性均明显高于空白对照组(P<0.05或P<0.01)。无菌敷贴组小鼠创面愈合速度缓慢,渗出较多;0 g/Lε-PL+SH组小鼠创面愈合速度前期与无菌敷贴组相近,后期较无菌敷贴组加快,渗出中等;5.0 g/Lε-PL+SH组小鼠创面愈合较另2组快,渗出不多。5.0 g/Lε-PL+SH组小鼠伤后3、7、12 d创面愈合率分别为(40.6±4.2)%、(64.3±4.1)%、(95.8±2.4)%,明显高于无菌敷贴组的(20.4±2.7)%、(38.9±2.2)%、(59.1±6.2)%与0 g/Lε-PL+SH组的(21.6±2.6)%、(44.0±1.7)%、(82.2±5.3)%(P<0.01);0 g/Lε-PL+SH组小鼠伤后7、12 d创面愈合率明显高于无菌敷贴组(P<0.05或P<0.01)。伤后12 d,5.0 g/Lε-PL+SH组小鼠创面几乎完全上皮化且炎症细胞浸润较少,0 g/Lε-PL+SH组小鼠创面部分上皮化且伴大量炎症细胞浸润,无菌敷贴组小鼠创面未见明显上皮化且伴大量炎症细胞浸润。结论基于TSPBA、聚乙烯醇、ε-PL及SH制备的复合微针可顺利刺穿小鼠皮肤并能通过缓慢响应创面中的活性氧从而溶解释放抗菌物质,抑制创面细菌定植,促进糖尿病小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面修复。 展开更多

关键词 糖尿病 伤口愈合 材料试验 微针 活性氧响应性 抗菌性 机械性能

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线粒体转录因子A和细胞色素c氧化酶途径对肿瘤坏死因子受体相关蛋白1调节大鼠缺氧心肌细胞能量生成的作用及机制 被引量：5

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作者 向飞 薛冬冬 +4 位作者 罗佳 胡建红 原莉莉 贾杰只 黄跃生 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期651-657,共7页

目的探讨线粒体转录因子A(TFAM)和细胞色素c氧化酶(COX)途径在肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)调节大鼠缺氧心肌细胞能量生成中的作用及机制。方法取135只1~3 d龄SD大鼠乳鼠,分离培养心肌细胞。(1)取细胞,按随机数字表法(分组方法下同... 目的探讨线粒体转录因子A(TFAM)和细胞色素c氧化酶(COX)途径在肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)调节大鼠缺氧心肌细胞能量生成中的作用及机制。方法取135只1~3 d龄SD大鼠乳鼠,分离培养心肌细胞。(1)取细胞,按随机数字表法(分组方法下同)分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组,每组1瓶。常氧空白对照组细胞常规培养;缺氧空白对照组细胞常规培养后缺氧6 h;缺氧+TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组细胞常规培养后,分别加入TRAP1过表达空病毒载体、TRAP1过表达腺病毒载体病毒悬液转染48 h后缺氧6 h。蛋白质印迹法检测各组细胞TFAM蛋白表达。(2)取细胞,分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧+TRAP1过表达对照组、缺氧+TRAP1过表达组、缺氧+TRAP1过表达+TFAM干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达+TFAM干扰组,每组1孔,前4组细胞处理同实验(1)对应组别。缺氧+TRAP1过表达+TFAM干扰对照组、缺氧+TRAP1过表达+TFAM干扰组细胞分别加入TFAM干扰空病毒载体、TFAM干扰腺病毒载体病毒悬液转染48 h,其他处理同缺氧+TRAP1过表达组。采用ATP检测试剂盒及酶标仪检测细胞内ATP含量,采用COX活性检测试剂盒及酶标仪检测细胞内COX活性。(3)取细胞,分为常氧空白对照组、常氧+叠氮化钠组、缺氧空白对照组、缺氧+叠氮化钠组,每组1孔,常氧空白对照组和缺氧空白对照组细胞处理同实验(1)对应组别。常氧+叠氮化钠组细胞实验前30 min加入32 nmol叠氮化钠,缺氧+叠氮化钠组细胞缺氧前30 min加入32 nmol叠氮化钠后缺氧6 h,同前检测ATP含量。以上实验均重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD检验。结果(1)与常氧空白对照组比较,缺氧空白对照组细胞TFAM蛋白表达量明显下降(P<0.01)。与缺氧空白对照组和缺氧+TRAP1过表达对照组比较,缺氧+TRAP1过表达组细胞TFAM蛋白表达量明显升高(P<0.01)。(2)与常氧空白对照组(0.552±0.041、1.99±0.15)比较,缺氧空白对照组细胞COX活性(0.270±0.044)和ATP含量(1.09±0.11)均明显降低(P<0.01)。与缺氧空白对照组和缺氧+TRAP1过表达对照组(0.269±0.042、1.17±0.12)比较,缺氧+TRAP1过表达组和缺氧+TRAP1过表达+TFAM干扰对照组细胞COX活性(0.412±0.032、0.404±0.016)和ATP含量(1.75±0.06、1.69±0.07)均明显升高(P<0.01)。与缺氧+TRAP1过表达组和缺氧+TRAP1过表达+TFAM干扰对照组比较,缺氧+TRAP1过表达+TFAM干扰组细胞COX活性(0.261±0.036)和ATP含量(1.23±0.07)均明显降低(P<0.01)。(3)与常氧空白对照组比较,常氧+叠氮化钠组和缺氧空白对照组细胞ATP含量明显降低(P<0.01)。与缺氧空白对照组比较,缺氧+叠氮化钠组细胞ATP含量明显降低(P<0.01)。结论TRAP1能够通过上调TFAM表达来提高COX活性,最终减轻缺氧导致的大鼠心肌细胞能量生成受损。 展开更多

关键词 肌细胞 心脏 缺氧 腺苷三磷酸 肿瘤坏死因子受体相关蛋白1 线粒体转录因子A 细胞色素C氧化酶

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低氧条件下B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B19 000相互作用蛋白3对人真皮微血管内皮细胞迁移和运动性的影响及其机制 被引量：1

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作者 张均辉 张琼 +5 位作者 贾杰只 李红梅 张灿 胡炯宇 张东霞 黄跃生 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期9-16,共8页

目的探讨低氧条件下B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3(BNIP3)对人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)迁移和运动性的影响及其机制。方法采用实验研究方法。(1)取HDMEC,采用随机数字表法(下同)分成行常规培养的常氧组及采用体积分数2... 目的探讨低氧条件下B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3(BNIP3)对人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)迁移和运动性的影响及其机制。方法采用实验研究方法。(1)取HDMEC,采用随机数字表法(下同)分成行常规培养的常氧组及采用体积分数2%氧气低氧处理相应时间点的低氧6、12、24 h组,采用蛋白质印迹法检测细胞中BNIP3及微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的蛋白表达。(2)取HDMEC,分成常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+BNIP3敲减组,分别转染空载病毒或BNIP3敲减病毒并进行常氧或低氧处理6 h,采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测BNIP3的蛋白表达;采用划痕试验检测划痕后24 h的划痕面积,并计算划痕愈合率;在活细胞工作站测算3 h内细胞运动的曲线距离,计算运动速度。(3)取HDMEC,同实验(2)分组及处理,采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测LC3Ⅱ的蛋白表达。以上实验样本数均为3。对数据行单因素方差分析及LSD检验。结果(1)与常氧组比较,低氧6、12、24 h组细胞BNIP3及LC3Ⅱ的蛋白表达量显著增加(P<0.01)。(2)培养6 h,与低氧+空载组比较,常氧+空载组和低氧+BNIP3敲减组细胞BNIP3的蛋白表达量显著下降(P<0.05或P<0.01)。常氧+空载组和常氧+BNIP3敲减组细胞中表示BNIP3蛋白表达的红色荧光较弱,低氧+空载组细胞红色荧光较强,低氧+BNIP3敲减组细胞中红色荧光较低氧+空载组明显减弱。划痕后24 h,低氧+空载组细胞划痕基本愈合,其他3组细胞剩余划痕面积较大。常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+BNIP3敲减组细胞划痕愈合率分别为(61±4)%、(58±4)%、(88±4)%、(57±4)%。低氧+空载组细胞划痕愈合率明显高于常氧+空载组(P<0.01)和低氧+BNIP3敲减组(P<0.05)。观察3 h内,低氧+空载组细胞运动范围较常氧+空载组显著增大,低氧+BNIP3敲减组细胞运动范围较低氧+空载组明显缩小;低氧+空载组细胞曲线运动速度较常氧+空载组和低氧+BNIP3敲减组明显增加(P<0.01)。(3)培养6 h,与低氧+空载组比较,常氧+空载组和低氧+BNIP3敲减组细胞LC3Ⅱ的蛋白表达量显著下降(P<0.05或P<0.01)。培养6 h,常氧+空载组和常氧+BNIP3敲减组细胞中表示LC3蛋白表达的红色荧光较弱,低氧+空载组细胞红色荧光明显增强,低氧+BNIP3敲减组细胞红色荧光被显著抑制。结论低氧条件下BNIP3可促进HDMEC的迁移和运动性,且自噬可能参与BNIP3对HDMEC迁移和运动性的调节。 展开更多

关键词 细胞低氧 细胞迁移分析 细胞运动 自噬 人真皮微血管内皮细胞 B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3

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体外研究己糖激酶Ⅱ在缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用 被引量：1

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作者 易若凡 林洁志 +5 位作者 崔琳 张琼 贾杰只 吕艳玲 张东霞 黄跃生 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期116-124,共9页

目的探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用。方法取6只1~2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验。(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、... 目的探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用。方法取6只1~2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验。(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、6、9 h组及缺血缺氧3、6、9 h组,每组4孔。DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)48 h后,正常对照3、6、9 h组更换新鲜DMEM/F12培养基分别培养3、6、9 h,缺血缺氧3、6、9 h组更换无糖无血清培养基后于37℃含体积分数1%氧气、体积分数5%二氧化碳的低氧培养箱(缺氧培养条件下同)内分别培养3、6、9 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力。(2)细胞分组及处理同实验(1),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞微管相关蛋白1轻链3 Ⅰ(LC3 Ⅰ)、LC3 Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。(3)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组和缺血缺氧9 h+2-脱氧葡萄糖(2-DG)组,每组4孔。常规培养48 h后,正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h;单纯缺血缺氧9 h组更换无糖无血清培养基,缺血缺氧9 h+2-DG组更换溶有物质的量浓度为10 mmol/L 2-DG(20 μmol)的无糖无血清培养基,2组均缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(4)细胞分组及处理同实验(3),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白表达。(5)细胞分组及处理同实验(3),每组2孔。透射电镜下观察心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体情况。(6)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+己糖激酶Ⅱ小干扰RNA1(HK-ⅡsiRNA1)组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组,每组4孔。正常对照组和单纯缺血缺氧9 h组常规培养48 h,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h。正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h,单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(7)细胞分组及处理同实验(6),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。除实验(5)外,各实验均重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞活力分别为0.450±0.022、0.385±0.010、0.335±0.015,分别明显低于对应正常对照3、6、9 h组的0.662±0.026、0.656 ±0.028、0.661±0.021(t=6.21、9.12、12.48,P<0.01)。(2)与对应正常对照3、6、9 h组比较,缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均显著增加(t3h=16.15、10.99、5.30,t6 h=6.79、10.42、9.42,t9h=15.76、16.51、7.20,P<0.05或P<0.01)。(3)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.353±0.022,较正常对照组的0.673 ±0.027明显降低(t=9.29,P<0.01);缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞活力为0.472 ±0.025,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.60,P<0.05)。(4)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显增加(t=9.45、8.40,P<0.01);与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显减少(t=4.39、4.74,P<0.05)。(5)正常对照组心肌细胞中仅可见个别双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体;与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞中双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体明显增多;与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体数量明显减少。(6)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.358±0.023,较正常对照组的0.673 ±0.026明显降低(t=9.12,P<0.01);缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA2组心肌细胞活力分别为0.487 ±0.027、0.493±0.022,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.63、4.28,P<0.05)。(7)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显增加(t=6.08、6.31、4.83,P<0.05或P<0.01);与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显减少(t=5.10、7.76、15.33,4.17、8.42、12.11,P<0.05或P<0.01)。结论缺血缺氧上调体外培养的小鼠心肌细胞己糖激酶Ⅱ蛋白表达水平,通过损害自噬流导致心肌细胞活力下降;抑制己糖激酶Ⅱ活性或其表达可减轻心肌细胞缺血缺氧损害。 展开更多

关键词 缺血 缺氧 肌细胞 心脏 己糖激酶 自噬 细胞活力

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心脏过表达三酰甘油脂肪酶对烧伤后心肌损害的影响及机制 被引量：1

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作者 李凌霏 张琼 +5 位作者 张星月 张均辉 冯燕海 吕艳玲 贾杰只 黄跃生 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期910-914,共5页

目的探讨心脏过表达三酰甘油脂肪酶(ATGL)对烧伤后小鼠心肌损害的影响及可能机制。方法随机选取8周龄心肌肌球蛋白重链(MHC)启动子驱动的心脏过表达ATGL雄性小鼠(MHC-ATGL烫伤组)和野生型雄性C57BL/6J小鼠(野生型烫伤组)构建烫伤模型,... 目的探讨心脏过表达三酰甘油脂肪酶(ATGL)对烧伤后小鼠心肌损害的影响及可能机制。方法随机选取8周龄心肌肌球蛋白重链(MHC)启动子驱动的心脏过表达ATGL雄性小鼠(MHC-ATGL烫伤组)和野生型雄性C57BL/6J小鼠(野生型烫伤组)构建烫伤模型,以同周龄和同性别的MHC-ATGL假烫伤小鼠(MHC-ATGL对照组)和野生型C57BL/6J假烫伤小鼠(野生型对照组)作为对照,每组8只。烫伤24 h后取材进行实验。分别检测心脏组织中ATGL蛋白表达水平、血清心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶、心脏组织游离脂肪酸含量和心脏组织活性氧水平。两烫伤组分别与其对照组进行比较,两烫伤组间同时进行比较。结果各组小鼠毛发颜色和生长发育无明显差异。野生型烫伤组心脏ATGL蛋白表达显著升高(1.00±0.68比3.09±0.93,P=0.023),而MHC-ATGL烫伤组心脏ATGL蛋白表达明显下降(17.84±2.41比10.36±2.22,P<0.001),但MHC-ATGL烫伤组心脏ATGL蛋白表达仍显著高于野生型烫伤组(P<0.001)。野生型烫伤组和MHC-ATGL烫伤组血清心肌肌钙蛋白T、血清肌酸激酶同工酶均显著高于其对照组[(0.456±0.131)比(0.076±0.019)μg/L和(0.219±0.089)比(0.060±0.019)μg/L、(1421±162)比(221±67)U/L和(761±142)比(221±41)U/L](均P<0.001),而MHC-ATGL烫伤组血清心肌肌钙蛋白T、血清肌酸激酶同工酶均显著低于野生型烫伤组(均P<0.001);野生型烫伤组心脏组织游离脂肪酸含量显著高于其对照组[(2.54±0.51)比(0.46±0.27)mmol/L](P<0.001),MHC-ATGL烫伤组无明显变化[(0.81±0.38)比(0.59±0.25)mmol/L](P=0.251),而MHC-ATGL烫伤组心脏游离脂肪酸含量显著低于野生型烫伤组(P<0.001)。野生型烫伤组和MHC-ATGL烫伤组心脏组织活性氧水平均显著高于其对照组[(1.89±0.23)比(1.00±0.18)和(1.38±0.17)比(0.95±0.13)](均P<0.001),而MHC-ATGL烫伤组心脏组织活性氧水平显著低于野生型烫伤组(P<0.001)。结论心脏过表达ATGL可能通过降低游离脂肪酸和活性氧生成减轻烧伤后心肌损害。 展开更多

关键词 烧伤 脂肪酶 心肌损害 脂肪酸类 非酯化 活性氧

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体外研究瞬时受体电位香草酸亚型1对缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制 被引量：1

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作者 韦劲宇 崔琳 +8 位作者 林洁志 张琼 袁红萍 向飞 宋华培 贾杰只 吕艳玲 张东霞 黄跃生 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期186-192,共7页

目的初步探讨瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)对体外培养的缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制。方法取120只1~2d龄雌雄不拘C57BL/6小鼠,分离心脏培养原代心肌细胞,并进行如下实验,分组方法均按照随机数字表法。(1)将细胞分为常氧组... 目的初步探讨瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)对体外培养的缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制。方法取120只1~2d龄雌雄不拘C57BL/6小鼠,分离心脏培养原代心肌细胞,并进行如下实验,分组方法均按照随机数字表法。(1)将细胞分为常氧组及缺氧3、6、9h组,每组1孔。常氧组细胞行常规培养(下同),缺氧3、6、9h组细胞采用不含胎牛血清的DMEM无糖培养基于体积分数1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气的低氧条件下分别培养3、6、9h。蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。(2)将细胞分为常氧组和缺氧组,每组2张盖玻片,其中缺氧组细胞同前缺氧处理6h。免疫荧光法检测TRPV1的阳性表达。(3)将细胞分为4组,每组1孔。单纯缺氧组细胞同前行缺氧处理6h;缺氧+0.1μmol/L辣椒素组、缺氧+1.0μmol/L辣椒素组、缺氧+10.0μmol/L辣椒素组细胞分别加入0.1、1.0、10.0μmol/L辣椒素处理30min后,行缺氧处理6h。蛋白质印迹法检测LC3、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。(4)将细胞分为5组,每组5孔。缺氧组细胞同前缺氧处理6h;缺氧+氯喹组、缺氧+辣椒素组、缺氧+辣椒素+氯喹组细胞分别加入50μmol/L氯喹、10.0μmol/L辣椒素、50μmol/L氯喹+10.0μmol/L辣椒素处理30min后缺氧处理6h。细胞计数试剂盒8法检测细胞活力。(5)将细胞分为单纯缺氧组及缺氧+10.0μmol/L辣椒素组,每组1孔,前者细胞同前缺氧处理6h;后者细胞加入10.0μmol/L辣椒素处理30min后,行缺氧处理6h。蛋白质印迹法检测溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)、LAMP-2的蛋白表达。各实验重复3次或5次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)与常氧组比较,缺氧3、6、9h组心肌细胞中LC3、Beclin-1、TRPV1蛋白表达明显增高(t3h=4.891、5.890、4.928,t6h=9.790、6.750、10.590,t9h=6.948、6.764、5.049,P<0.05或P<0.01);缺氧6h组3种蛋白表达最高,分别为1.08±0.05、1.12±0.10、0.953±0.071。(2)缺氧组TRPV1在心肌细胞膜和胞内密度明显增加,呈团块状分布,表达明显强于常氧组。(3)与单纯缺氧组比较,缺氧+0.1μmol/L辣椒素组心肌细胞中Beclin-1蛋白表达明显增高(t=10.488,P<0.01),LC3和TRPV1蛋白表达虽增高但差异无统计学意义(t=4.372、3.026,P>0.05);缺氧+1.0μmol/L辣椒素组、缺氧+10.0μmol/L辣椒素组心肌细胞中LC3和TRPV1、Beclin-1蛋白表达均明显增高(t=15.505、5.773、13.430,20.915、8.054、16.384,P<0.05或P<0.01),其中缺氧+10.0μmol/L辣椒素组3种蛋白表达均达峰值,分别为2.33±0.09、1.34±0.07、1.246±0.053。(4)与常氧组(0.585±0.045)比较,缺氧组心肌细胞活力明显下降(0.471±0.037,t=4.365,P<0.05);与缺氧组比较,缺氧+氯喹组心肌细胞活力进一步明显下降(0.350±0.023,t=6.216,P<0.01),缺氧+辣椒素组心肌细胞活力则明显升高(0.564±0.047,t=3.489,P<0.05);与缺氧+氯喹组比较,缺氧+辣椒素+氯喹组心肌细胞活力无明显变化(0.364±0.050,t=0.545,P>0.05)。(5)与单纯缺氧组(0.99±0.04、0.54±0.04)比较,缺氧+10.0μmol/L辣椒素组心肌细胞中LAMP-1和LAMP-2蛋白表达明显增加(1.49±0.06、0.81±0.05,t=12.550、7.442,P<0.01)。结论TRPV1通过自噬-溶酶体途径进一步促进缺氧早期小鼠心肌细胞自噬相关蛋白的表达,增强自噬活性,改善自噬流,减轻早期缺氧心肌细胞的损伤。 展开更多

关键词 自噬 缺氧 肌细胞 心脏 瞬时受体电位香草酸亚型1

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体外研究小鼠心肌细胞自噬过程中人抗原R对溶酶体酸化的作用 被引量：1

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作者 林洁志 易若凡 +8 位作者 张星月 贾杰只 张琼 崔琳 杨雷 叶晶莹 张东霞 吕艳玲 黄跃生 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期169-178,共10页

目的探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用。方法取1~2d龄C57BL/6小鼠(雌雄不限)20只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验。(1)采用随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为5组,即正常对照组和无糖无血清... 目的探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用。方法取1~2d龄C57BL/6小鼠(雌雄不限)20只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验。(1)采用随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为5组,即正常对照组和无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组。正常对照组用DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)54.0h,无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组常规培养53.5、53.0、51.0、48.0h后更换无糖无血清培养基分别处理0.5、1.0、3.0、6.0h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白5、腺苷三磷酸酶V1区E1亚基(ATP6V1E1)蛋白表达。(2)将细胞分为正常对照组和无糖无血清3.0h组,相应各组细胞处理同实验(1),激光扫描共聚焦显微镜下观测细胞溶酶体酸化水平。(3)取2个批次细胞,均同实验(1)分组处理,蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白及另一个批次细胞胞质、胞核蛋白中人抗原R蛋白表达。(4)将细胞分为正常对照组、单纯对照小干扰RNA(siRNA)组、单纯人抗原R-siRNA1(HuR-siRNA1)组、单纯HuR-siRNA2组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组。常规培养48h后,单纯对照siRNA组及无糖无血清+对照siRNA组加入阴性对照siRNA、单纯HuR-siRNA1组及无糖无血清+HuR-siRNA1组加入HuR-siRNA1、单纯HuR-siRNA2组及无糖无血清+HuR-siRNA2组加入HuR-siRNA2转染6h,8组均继续常规培养48h后,正常对照组及各单纯siRNA处理组更换DMEM/F12培养基、其余各组更换无糖无血清培养基培养3h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达。(5)取2个批次细胞,均分为无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),免疫荧光法观测一个批次细胞人抗原R分布及表达,激光扫描共聚焦显微镜下观测另一批次细胞溶酶体酸化水平。(6)取3个批次细胞,均分为无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组,相应各组细胞处理同实验(4),蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白中组织蛋白酶D、一个批次细胞胞质蛋白中人抗原R及另一个批次细胞总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达。(7)将细胞分为正常对照组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),实时荧光定量反转录PCR法检测细胞ATP6V1E1mRNA表达。各实验样本数均为3。对数据进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中LC3Ⅱ、ATP6V1E1蛋白表达显著增加(t=12.16、4.05、4.82,11.64、3.29、8.37,P<0.05或P<0.01),无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中自噬相关蛋白5蛋白表达显著增加(t=6.88、10.56、5.76、9.91,P<0.05或P<0.01)。(2)与正常对照组的1.03±0.08比较,无糖无血清3.0h组细胞溶酶体酸化水平(2.92±0.30)明显升高(t=6.01,P<0.01)。(3)5组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达组间总体比较,差异无统计学意义(F=1.09,P>0.05)。与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞胞质蛋白中人抗原R蛋白表达显著增加(t=43.05、11.07、5.39,P<0.05或P<0.01),无糖无血清3.0、6.0h组细胞胞核蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=11.18、12.71,P<0.01)。(4)与单纯对照siRNA组比较,单纯HuR-siRNA1组、单纯HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.82、4.44,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.39、6.27,P<0.05)。(5)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞胞质中人抗原R分布减少、表达水平显著降低(t=10.13,P<0.01)。与无糖无血清+对照siRNA组的1.00±0.06比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞溶酶体酸化水平(0.73±0.06)显著下降(t=3.28,P<0.01)。(6)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中组织蛋白酶D、胞质蛋白中人抗原R、总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达均显著减少(t=4.16、3.99,4.81、5.07,11.68、12.97,P<0.05或P<0.01)。(7)与正常对照组比较,无糖无血清3.0h组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著增加(t=5.51,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著减少(t=5.97,P<0.05)。结论小鼠原代心肌细胞在体外无糖无血清处理后自噬激活、溶酶体酸化增强、胞质中人抗原R表达增加,人抗原R功能激活并参与维持小鼠心肌细胞自噬过程中的溶酶体酸化。 展开更多

关键词 肌细胞 心脏 自噬 人抗原R 溶酶体酸化

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CD38分子介导烧伤小鼠缺血缺氧性心肌损伤的机制

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作者 张星月 张琼 +6 位作者 李凌霏 林洁志 张均辉 张东霞 吕艳玲 贾杰只 黄跃生 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期904-908,909,共6页

目的探讨CD38分子介导烧伤小鼠缺血缺氧性心肌损伤的机制。方法随机选取8周龄CD38-/-雄性小鼠和野生型(WT)雄性C57BL/6J小鼠各20只构建烧伤模型,动物实验分为WT对照组、CD38-/-对照组、WT烧伤组、CD38-/-烧伤组各10只,烧伤24 h后取材进... 目的探讨CD38分子介导烧伤小鼠缺血缺氧性心肌损伤的机制。方法随机选取8周龄CD38-/-雄性小鼠和野生型(WT)雄性C57BL/6J小鼠各20只构建烧伤模型,动物实验分为WT对照组、CD38-/-对照组、WT烧伤组、CD38-/-烧伤组各10只,烧伤24 h后取材进行实验。利用出生1 d的小鼠乳鼠培养原代心肌细胞构建细胞缺血缺氧模型。细胞实验分为WT常氧组、CD38-/-常氧组、CD38-/-+Ad-CD38常氧组、WT缺血缺氧组、CD38-/-缺血缺氧组、CD38-/-+Ad-CD38缺血缺氧组。通过检测乳酸脱氢酶(LDH)释放及细胞活性明确心肌细胞缺血缺氧损伤程度;电镜检测心肌细胞超微结构;免疫印迹检测心肌细胞中CD38蛋白及线粒体凋亡相关蛋白水平;流式细胞技术检测心肌细胞线粒体活性氧(MitoSOX)水平;凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡情况;小动物超声仪检测小鼠心功能。结果(1)动物实验:WT烧伤组CD38表达水平显著高于WT对照组(P<0.001),CD38-/-烧伤组心功能明显优于WT烧伤组[射血分数:(84.70±2.31)%比(76.10±2.96)%;短轴缩短率:(48.90±5.00)%比(38.10±2.80)%](均P<0.001)。(2)细胞实验:WT缺血缺氧组CD38表达水平高于WT常氧组(P<0.05);CD38-/-缺血缺氧组LDH释放水平、心肌细胞凋亡率、MitoSOX水平均显著低于WT缺血缺氧组和CD38-/-+Ad-CD38缺血缺氧组[(11.2±3.0)%比(18.2±3.4)%和(17.6±4.0)%、(13.0±2.8)%比(23.1±4.9)%和(23.3±6.0)%、(162±11)%比(228±18)%和(220±18)%](均P<0.001),活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、细胞色素C也有相似结果(均P<0.001);细胞活性均显著高于上述两组(0.355±0.043比0.280±0.051和0.291±0.024)(均P<0.05)。电镜结果显示CD38-/-缺血缺氧组心肌细胞内线粒体结构优于WT缺血缺氧组及CD38-/-+Ad-CD38缺血缺氧组。结论心肌细胞内高表达的CD38分子促进线粒体凋亡因子释放,诱导心肌细胞凋亡,介导烧伤小鼠缺血缺氧性心肌损伤。 展开更多

关键词 烧伤 抗原 CD38 心肌缺血 线粒体凋亡

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