目的建立一种经济快速、准确灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR检测方法。方法对30个ASFV毒株来源的P72基因进行多重序列比对,根据其保守区域设计两对特异性引物,PCR扩增P72基因。以含ASFV P72基因保守区域的目的片段的重组标准质粒P...目的建立一种经济快速、准确灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR检测方法。方法对30个ASFV毒株来源的P72基因进行多重序列比对,根据其保守区域设计两对特异性引物,PCR扩增P72基因。以含ASFV P72基因保守区域的目的片段的重组标准质粒PUC57-P72为模板,建立荧光染料TB Green qPCR方法,绘制标准曲线并筛选最佳引物对。通过优化反应体系和条件,提高最佳引物对的检测灵敏性,并进行重复性检测。选用常见猪病毒如猪流感病毒H1N1、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸与ASFV标准质粒为模板进行特异性试验;通过检测已知ASFV阳性和阴性参考样品评估方法的符合率。结果优选的基于P72基因的特异性引物对及反应体系,能扩增1.0~1.0×10^(6)copies/μL的ASFV P72标准质粒,建立的标准曲线R^(2)可达0.9954;该方法最低可检测到1 copyies/μL的目的基因,优于TaqMan探针法扩增灵敏度;该方法的扩增反应采用两步法,耗时<1 h;方法的批内变异系数<1%,批间变异系数<2%;该方法针对ASFV扩增的特异性强,检测其它4种常见猪病毒均未发生交叉阳性反应;用该方法检测4份随机抽取的ASFV灭活参考样品均阳性,4份SPF级的巴拿马香猪组织样品均阴性,符合率为100%。结论建立的TB Green qPCR方法经济、快速,灵敏、特异,可作为非洲猪瘟的分子诊断方法。展开更多
文摘目的建立一种经济快速、准确灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR检测方法。方法对30个ASFV毒株来源的P72基因进行多重序列比对,根据其保守区域设计两对特异性引物,PCR扩增P72基因。以含ASFV P72基因保守区域的目的片段的重组标准质粒PUC57-P72为模板,建立荧光染料TB Green qPCR方法,绘制标准曲线并筛选最佳引物对。通过优化反应体系和条件,提高最佳引物对的检测灵敏性,并进行重复性检测。选用常见猪病毒如猪流感病毒H1N1、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸与ASFV标准质粒为模板进行特异性试验;通过检测已知ASFV阳性和阴性参考样品评估方法的符合率。结果优选的基于P72基因的特异性引物对及反应体系,能扩增1.0~1.0×10^(6)copies/μL的ASFV P72标准质粒,建立的标准曲线R^(2)可达0.9954;该方法最低可检测到1 copyies/μL的目的基因,优于TaqMan探针法扩增灵敏度;该方法的扩增反应采用两步法,耗时<1 h;方法的批内变异系数<1%,批间变异系数<2%;该方法针对ASFV扩增的特异性强,检测其它4种常见猪病毒均未发生交叉阳性反应;用该方法检测4份随机抽取的ASFV灭活参考样品均阳性,4份SPF级的巴拿马香猪组织样品均阴性,符合率为100%。结论建立的TB Green qPCR方法经济、快速,灵敏、特异,可作为非洲猪瘟的分子诊断方法。
