目的系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙...目的系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行诱导表达,确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Western blot鉴定,分析诱导前、诱导后细菌裂解液中的目的蛋白,并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。将纯化后蛋白与病毒荧光探针进行孵育,复合物于非变性凝胶中电泳检测纯化蛋白功能。结果成功构建了AR全长和3个功能域截短体的原核表达质粒。PCR和双酶切鉴定均显示在各插入片段大小相符处出现阳性条带,且测序结果与NCBI GenBank标准株比对一致。其中,96 ku GST-AR-NTD+DBD与86 ku GST-AR-NTD两个融合蛋白得以成功表达及后续纯化。纯化蛋白可与病毒基因组DNA直接结合。结论来源同一基因序列的AR截短体重组质粒原核表达条件不同,纯化后的AR蛋白可用于深入了解AR各功能域与其他分子间的直接相互作用机制。展开更多
病毒感染可引起世界范围内12%左右癌症的发生,每年约有130万例患者死亡。目前一个重要的瓶颈问题就是所有类型的肿瘤病毒均缺乏可广泛使用的体内研究模型。肝癌是全球第四大癌症相关死亡原因,其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC...病毒感染可引起世界范围内12%左右癌症的发生,每年约有130万例患者死亡。目前一个重要的瓶颈问题就是所有类型的肿瘤病毒均缺乏可广泛使用的体内研究模型。肝癌是全球第四大癌症相关死亡原因,其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占80%,是最常见的类型。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关的HCC在我国尤为严重,占据所有病例的60%以上。慢性HBV感染是发生肝癌最重要的危险因素,但目前对此类患者仍缺乏有效治愈手段。因此,明确HBV与宿主的互作方式及其致瘤机制是制定临床治疗策略的前提。近几十年来,HBV病毒相关肝癌小鼠模型的建立和应用得以不断发展,伴随精准医学的进步出现了更多复杂的新模型和大量研究成果。本综述回顾分析现有基因工程小鼠和人源化小鼠在此类模型的构建方法等方面的特点,并进一步总结需应用于研究病毒致瘤机制时应特别注意的适用范围或优缺点。展开更多
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我国面临的重大公共卫生问题。尽管过去30年人们对HBV及HBV感染相关性肝细胞癌已有了相当深入的认识,但仍有大量关于HBV生命周期和病毒发病机制的问题亟待解决。由于缺乏HBV感染背景下可广泛...乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我国面临的重大公共卫生问题。尽管过去30年人们对HBV及HBV感染相关性肝细胞癌已有了相当深入的认识,但仍有大量关于HBV生命周期和病毒发病机制的问题亟待解决。由于缺乏HBV感染背景下可广泛使用的模式动物模型,所以制约了HBV研究的快速发展。本研究全面梳理了现有HBV小鼠模型在病毒学特征和致病性方面的不同侧重点。以HBV关键病毒学行为如病毒复制、共价闭合环状DNA的形成和持续性感染为关键词,建立不同处理手段与模型特征之间的相关性,从而便于选择正确模型开展针对性的研究,并基于此筛查有效治疗方案。展开更多
文摘目的系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行诱导表达,确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Western blot鉴定,分析诱导前、诱导后细菌裂解液中的目的蛋白,并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。将纯化后蛋白与病毒荧光探针进行孵育,复合物于非变性凝胶中电泳检测纯化蛋白功能。结果成功构建了AR全长和3个功能域截短体的原核表达质粒。PCR和双酶切鉴定均显示在各插入片段大小相符处出现阳性条带,且测序结果与NCBI GenBank标准株比对一致。其中,96 ku GST-AR-NTD+DBD与86 ku GST-AR-NTD两个融合蛋白得以成功表达及后续纯化。纯化蛋白可与病毒基因组DNA直接结合。结论来源同一基因序列的AR截短体重组质粒原核表达条件不同,纯化后的AR蛋白可用于深入了解AR各功能域与其他分子间的直接相互作用机制。
文摘病毒感染可引起世界范围内12%左右癌症的发生,每年约有130万例患者死亡。目前一个重要的瓶颈问题就是所有类型的肿瘤病毒均缺乏可广泛使用的体内研究模型。肝癌是全球第四大癌症相关死亡原因,其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占80%,是最常见的类型。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关的HCC在我国尤为严重,占据所有病例的60%以上。慢性HBV感染是发生肝癌最重要的危险因素,但目前对此类患者仍缺乏有效治愈手段。因此,明确HBV与宿主的互作方式及其致瘤机制是制定临床治疗策略的前提。近几十年来,HBV病毒相关肝癌小鼠模型的建立和应用得以不断发展,伴随精准医学的进步出现了更多复杂的新模型和大量研究成果。本综述回顾分析现有基因工程小鼠和人源化小鼠在此类模型的构建方法等方面的特点,并进一步总结需应用于研究病毒致瘤机制时应特别注意的适用范围或优缺点。
基金Supported by National Natural Science Foundation of China(No.81872372 and No.81902469)2020 Li Ka Shing Foundation Cross-Disciplinary Research Grant(No.2020LKSFG07B)。
文摘乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我国面临的重大公共卫生问题。尽管过去30年人们对HBV及HBV感染相关性肝细胞癌已有了相当深入的认识,但仍有大量关于HBV生命周期和病毒发病机制的问题亟待解决。由于缺乏HBV感染背景下可广泛使用的模式动物模型,所以制约了HBV研究的快速发展。本研究全面梳理了现有HBV小鼠模型在病毒学特征和致病性方面的不同侧重点。以HBV关键病毒学行为如病毒复制、共价闭合环状DNA的形成和持续性感染为关键词,建立不同处理手段与模型特征之间的相关性,从而便于选择正确模型开展针对性的研究,并基于此筛查有效治疗方案。
