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非洲猪瘟病毒MGF360-13L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
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作者 陈世钰 蒋亚君 +5 位作者 鑫婷 崔帅 王洋 郭晓宇 贾红 朱鸿飞 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期194-201,共8页
本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF360-13L基因原核表达系统表达13L蛋白,并制备其鼠源多克隆抗体。利用生物信息学方法,对ASFV MGF360-13L基因进行序列比对,分析其同源性、构建遗传进化树;将非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因密码子优... 本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF360-13L基因原核表达系统表达13L蛋白,并制备其鼠源多克隆抗体。利用生物信息学方法,对ASFV MGF360-13L基因进行序列比对,分析其同源性、构建遗传进化树;将非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因密码子优化后进行合成,连接至PET32a载体构建重组质粒pET32a-13L,转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达获得目的蛋白,采用镍柱纯化法进行蛋白纯化。将纯化后的蛋白乳化后免疫8周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测抗体特异性。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白分子量大小为58.2 kDa,主要以包涵体形式存在;Western blot结果显示免疫猪阳性血清可特异性识别该蛋白,具有良好的反应性,表明该重组蛋白获得正确表达。利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体进行Western blot,结果显示其能与MGF360-13L重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定抗体效价高达1∶256000。本研究成功制备非洲猪瘟病毒MGF360-13L重组蛋白,以其为免疫原制备的多克隆抗体具备较高的特异性和反应性,为进一步阐述MGF360-13L蛋白的生物学功能和研制非洲猪瘟新型疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 MGF360-13L基因 序列分析 原核表达 多克隆抗体
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4种牛分枝杆菌特异性基因PCR检测方法的比较与评价
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作者 辛凌翔 王豪杰 +6 位作者 刘燕 姚文生 胡云皓 张一帜 赵浩然 鑫婷 朱良全 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第12期55-61,共7页
牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物,PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法,以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和M... 牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物,PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法,以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和Mpb64)分别设计引物,通过温度梯度PCR法确定最适退火温度;采用牛分枝杆菌参考株核酸确定PCR最小检测限,同时运用牛分枝杆菌国内参考株、牛分枝杆菌国际参考株、禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌、羊种布鲁菌以及牛种布鲁菌进行特异性比较试验;最后运用人工模拟牛分枝杆菌感染组织样本(肺脏、淋巴结、奶样)比较不同PCR方法检测效果。4对引物以60℃为退火温度时均能检测分枝杆菌,其中IS6110、IS1081和Mpb64基因引物可以特异性检测牛分枝杆菌。IS6110和IS1081基因引物对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度最高,可达10^(-10) ng/μL;IS6110基因引物在肺脏和淋巴结中牛分枝杆菌检测灵敏度可达10~6 CFU/mL以上,而Mpb64基因引物对奶样中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达10~2 CFU/mL。本研究筛选出相对适宜的牛分枝杆菌PCR检测方法,为牛结核病病原学检测和临床应用提供技术支持。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 病原 PCR 灵敏度 特异性
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犊牛感染性腹泻的流行现状及综合防控 被引量:4
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作者 贾丽 武英豪 +6 位作者 李燕 张建伟 彭清洁 鑫婷 张广智 马玉忠 丁家波 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第12期139-144,共6页
犊牛感染性腹泻是一类严重影响犊牛生长发育和畜牧养殖业经济效益的常见疾病。犊牛常因饲养条件不佳与环境卫生管理不当导致机体免疫功能下降而引起腹泻。近些年,犊牛感染性腹泻的比率有不断上升的趋势,致病因素主要是病毒、细菌和寄生... 犊牛感染性腹泻是一类严重影响犊牛生长发育和畜牧养殖业经济效益的常见疾病。犊牛常因饲养条件不佳与环境卫生管理不当导致机体免疫功能下降而引起腹泻。近些年,犊牛感染性腹泻的比率有不断上升的趋势,致病因素主要是病毒、细菌和寄生虫等病原微生物。引起犊牛腹泻常见病原包括牛轮状病毒、牛冠状病毒、产肠毒素大肠埃希菌和隐孢子虫等,其中部分病原还会发生混合感染,导致犊牛继发呼吸道疾病、乳房炎、蹄病等,极大地增加治疗的难度。各个地区流行情况的监测有助于加强地区的治理,保护动物和人类健康,以免感染性腹泻的暴发。本文对犊牛感染性腹泻的流行现状、病原特征、检测和防治手段结合临床治疗经验进行综述,以期为犊牛感染性腹泻的防控提供参考依据。 展开更多
关键词 犊牛 感染性腹泻 病原 流行病学 检测 防治
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猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量:21
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作者 鑫婷 侯绍华 +5 位作者 贾红 郭晓宇 丁家波 李延鹏 丁敏 朱鸿飞 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期185-191,共7页
【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临... 【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP 检测
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猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学分析 被引量:4
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作者 鑫婷 侯绍华 +3 位作者 贾红 丁敏 郭晓宇 朱鸿飞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第8期115-121,共7页
为研究中国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因变异情况,对GenBank中公布的中国不同时间和地区分离的53株PRRSV毒株的N、GP5基因序列分别进行了遗传变异分析。根据N基因构建的遗传进化树分析表明,所有的中国大陆分离株均属于美洲型(N... 为研究中国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因变异情况,对GenBank中公布的中国不同时间和地区分离的53株PRRSV毒株的N、GP5基因序列分别进行了遗传变异分析。根据N基因构建的遗传进化树分析表明,所有的中国大陆分离株均属于美洲型(NA),中国的PRRSV分离株可分为4个亚群,亚群1中的毒株主要分布在中国东南部地区,其GP5主要中和抗原表位基因高度变异;亚群2主要为以CH1a株为代表的毒株;亚群3中的毒株与疫苗株MLV和VR2332高度一致;而台湾地区的分离株与大陆地区的分离株差异较大,单独归属于亚群4。这些研究结果对了解中国流行的PRRSV毒株的分子流行病学具有重要意义,也可部分解释MLV或灭活的CH1a疫苗对亚群1病毒感染猪保护力较低的原因,为今后制定PRRS的防控措施提供科学依据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合症病毒 N基因 GP5基因 遗传变异 分子流行病学
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非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 被引量:14
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作者 刘雪婷 王召阳 +6 位作者 鑫婷 郭晓宇 姜一曈 崔帅 于海男 朱鸿飞 贾红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第3期991-1000,共10页
本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1(GenBank登录号:FR682468.1)公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a(+)载体,构建pET-28a-B... 本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1(GenBank登录号:FR682468.1)公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a(+)载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在16℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1∶64000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) B438L基因 p49重组蛋白 原核表达 多克隆抗体
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基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立 被引量:9
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作者 姜一曈 王昭华 +4 位作者 鑫婷 贾红 郭晓宇 朱鸿飞 侯绍华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期926-929,共4页
为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验... 为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法。该方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出CPV。特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×10~1拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍。利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88%,高于普通PCR的检出率(82%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测。 展开更多
关键词 犬细小病毒 重组酶聚合酶扩增技术 快速检测
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细粒棘球蚴EG95s重组蛋白串联表达免疫原性分析 被引量:4
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作者 贾红 袁维峰 +5 位作者 李杰 侯绍华 郭晓宇 鑫婷 马世春 朱鸿飞 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期843-847,共5页
目的比较、分析EG95s重组蛋白的免疫原性。方法本研究分别诱导表达含有1、2、3拷贝EG95s的pET-1EG95s、pET-2EG95s和pET-3EG95s重组质粒,并用His亲和纯化HIS-1EG95s、HIS-2EG95s和HIS-3EG95s3种重组蛋白。再以相同的免疫程序分别免疫8周... 目的比较、分析EG95s重组蛋白的免疫原性。方法本研究分别诱导表达含有1、2、3拷贝EG95s的pET-1EG95s、pET-2EG95s和pET-3EG95s重组质粒,并用His亲和纯化HIS-1EG95s、HIS-2EG95s和HIS-3EG95s3种重组蛋白。再以相同的免疫程序分别免疫8周龄BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法检测小鼠体内抗体水平的变化分析其免疫原性。结果经过改造的EG95s重组蛋白:HIS-1EG95s、HIS-2EG95s、HIS-3EG95s均保留了免疫原性,能诱导小鼠产生特异性抗体。3者抗体水平的比较结果显示HIS-1EG95s首次免疫后1周产生的抗体水平明显高于HIS-2EG95s、HIS-3EG95s,但免疫后2周开始,HIS-3EG95s抗体水平超过HIS-1EG95s组,并在二次免疫及三次免疫后持续高于HIS-1EG95s组。免疫后最终抗体效价显示HIS-1EG95s和HIS-2EG95s两组均为1∶819 200,而HIS-3EG95s组为1∶1 638 400。HIS-1EG95s、HIS-2EG95s、HIS-3EG95s均诱导机体产生IFN-γ,但差异不显著,与羊包虫阳性血清反应结果显示HIS-1EG95s的反应性均显著低于HIS-2EG95s和HIS-3EG95s。结论 HIS-1EG95s、HIS-2EG95s与HIS-3EG95s均具有很好的免疫原性,虽HIS-EG95s在免疫初期免疫效果好,但串联3拷贝的EG95s后使得重组蛋白免疫效果更持久,更有利于产生更长效的免疫保护作用。本研究为羊包虫病疫苗的研制及免疫预防奠定了科学基础。 展开更多
关键词 细粒棘球蚴 免疫原性
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牛结核病对人类健康的影响及其诊断方法 被引量:9
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作者 贾红 鑫婷 +3 位作者 郭晓宇 袁维峰 侯绍华 朱鸿飞 《微生物与感染》 2014年第1期6-13,共8页
牛结核病是一种非常重要的人畜共患病,其流行不但对畜牧业的发展产生直接影响,而且会通过各种途径感染人类,给公共卫生带来严重威胁。本文主要就牛结核病的发现、与人结核病之间的关系、对人类健康的影响及其目前的诊断方法等进行介绍。
关键词 牛结核病 人结核病 诊断
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牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价 被引量:2
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作者 李明 贾红 +10 位作者 鑫婷 郭晓宇 袁维锋 侯邵华 侯强 高新桃 吴竞 董瑞凯 杨宏军 刘来兴 朱鸿飞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第10期2544-2550,共7页
为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验... 为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验)和间接ELISA对重组蛋白的活性进行评价。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组蛋白大小与理论值相符,且能与鼠抗His的抗体反应有特异性条带;在TST试验、IGRA试验和间接ELISA中也表现出抗原活性。结果表明,重组Mb1230蛋白具有良好的B细胞活性和T细胞活性,在牛结核病诊断中具有应用潜力。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 Mb1230 原核表达 牛结核病诊断
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重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价 被引量:2
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作者 宋天琪 侯绍华 +5 位作者 郭晓宇 鑫婷 姜一曈 袁维峰 朱鸿飞 贾红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第7期2144-2150,共7页
试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接... 试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10^7 IU/mL,比活性为1.58×10^7 IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。 展开更多
关键词 犬α6干扰素(CaIFN-α6) 真核表达 纯化 抗病毒活性
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抗猪圆环病毒2型病毒样颗粒单克隆抗体的制备及鉴定 被引量:1
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作者 侯强 侯绍华 +5 位作者 贾红 姜一曈 鑫婷 李明 陈青 朱鸿飞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期325-329,共5页
为制备能够特异性识别猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)的单克隆抗体(MAb),本研究利用杆状病毒表达系统分别制备了具有VLP结构的核衣壳蛋白(Cap)和去掉核定位信号肽的tCap蛋白,以前者为免疫原,后者为筛选抗原制备了一株杂交瘤细胞(1F... 为制备能够特异性识别猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)的单克隆抗体(MAb),本研究利用杆状病毒表达系统分别制备了具有VLP结构的核衣壳蛋白(Cap)和去掉核定位信号肽的tCap蛋白,以前者为免疫原,后者为筛选抗原制备了一株杂交瘤细胞(1F6),通过western blot、间接免疫荧光和透射电镜对其生物学特性进行鉴定。结果显示,1F6 MAb与PCV2 VLP具有良好的特异性反应,同时能够特异性识别天然PCV2和线性结构的Cap蛋白。本研究制备的MAb为PCV2抗原表位的鉴定和PCV2 VLP定量方法的建立提供了工具。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 单克隆抗体 核衣壳蛋白 病毒样颗粒
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11种牛分枝杆菌抗原在牛结核病诊断中的初步评价 被引量:6
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作者 高新桃 贾红 +7 位作者 侯绍华 杨宏军 郭晓宇 袁维峰 姜一曈 朱鸿飞 鑫婷 丁家波 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第8期2282-2292,共11页
为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和... 为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH),而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异(P>0.05)。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛(P<0.05)。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 牛结核病 诊断 抗体 皮试试验 IFN-γ释放试验
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非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备 被引量:6
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作者 蒋亚君 陈世钰 +7 位作者 鑫婷 郭晓宇 王召阳 刘雪婷 崔帅 王洋 朱鸿飞 贾红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第1期352-360,共9页
【目的】获得抗原性好的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。【方法】根据GenBank ASFV参考序列(登录号:NC_044959.2)合成360-12L基因,并插入pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将... 【目的】获得抗原性好的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。【方法】根据GenBank ASFV参考序列(登录号:NC_044959.2)合成360-12L基因,并插入pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。【结果】成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37℃6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1∶512000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体具有良好的特异性,可特异性识别12L重组蛋白。【结论】原核表达的12L重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究12L蛋白的生物学功能、ASFV血清学诊断技术和疫苗研究提供生物材料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 原核表达 12L重组蛋白 多克隆抗体
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细胞因子IL-17作为牛结核病诊断标志物的研究及实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 高新桃 贾红 +5 位作者 侯绍华 郭晓宇 袁维峰 姜一曈 朱鸿飞 鑫婷 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第6期1447-1453,共7页
试验旨在评价细胞因子IL-6和IL-17mRNA转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验临床筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,采集试验动物抗凝全血,分离、收集外周血淋巴细... 试验旨在评价细胞因子IL-6和IL-17mRNA转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验临床筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,采集试验动物抗凝全血,分离、收集外周血淋巴细胞,分别用牛结核菌素(PPD-B)、禽结核菌素(PPD-A)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、pET-32a载体标签蛋白(PET)或PBS 37℃培养6h,用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的mRNA相对转录水平。结果显示,PET和空白对照PBS类似,不能刺激细胞因子mRNA转录水平的提高,表明CE中包含的PET对试验的影响可忽略不计;牛外周血淋巴细胞经PPD-B、PPD-A或CE刺激后,结核病阳性牛样品中IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平均显著高于结核病阴性牛(P<0.05),其中PPD-B刺激效果强于CE和PPD-A,而CE刺激的特异性更好;选取CE作为最佳刺激源,结果显示,IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平之间相关性良好(spearman r=0.79),并初步建立了基于IL-17和IFN-γ转录水平的实时荧光定量PCR检测方法;以此方法对14头结核病阳性牛进行临床检验,IL-17实时荧光定量PCR法的阳性样本检出率为85.7%,高于IFN-γ(71.4%)。本研究结果初步表明,牛分枝杆菌特异性抗原(PPD-B、CE)诱导的IL-17mRNA转录水平与牛结核病相关,以CE为刺激源建立的IL-17实时荧光定量PCR检测方法具有用于牛结核病诊断的潜力。 展开更多
关键词 牛结核病 诊断 IL-17 IFN-Γ 实时荧光定量PCR
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抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选 被引量:5
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作者 王召阳 蒋亚君 +6 位作者 刘雪婷 林伟东 鑫婷 侯绍华 郭晓宇 朱鸿飞 贾红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第6期1685-1693,共9页
为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑... 为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1∶25000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×109 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒(CDV) VHH抗体 M13噬菌体展示 真核表达
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非洲猪瘟病毒MGF360-14L靶向MAVS抑制Ⅰ型干扰素的产生 被引量:3
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作者 王洋 崔帅 +10 位作者 鑫婷 王西西 于海男 陈世钰 蒋亚君 高新桃 庞忠宝 姜一曈 郭晓宇 贾红 朱鸿飞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期3272-3278,共7页
本研究旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)多基因家族成员MGF360-14L对Ⅰ型干扰素(IFN)的抑制作用及其作用机制。通过双荧光素酶试验检测MGF360-14L对线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)诱导的干扰素β(IFN-β)启动子活性... 本研究旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)多基因家族成员MGF360-14L对Ⅰ型干扰素(IFN)的抑制作用及其作用机制。通过双荧光素酶试验检测MGF360-14L对线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)诱导的干扰素β(IFN-β)启动子活性的影响,免疫共沉淀和激光共聚焦检测MGF360-14L与MAVS的互作关系,及Western blot分析MGF360-14L对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化的影响。结果表明,ASFV非结构蛋白MGF360-14L抑制MAVS诱导的IFN-β启动子活性。MGF360-14L能够与MAVS互作,并且对MAVS和TRIM21诱导的TBK1和IRF3磷酸化具有抑制作用。此外,当过表达MGF360-14L时,MGF360-14L蛋白与TRIM21竞争结合MAVS,抑制TRIM21对MAVS的泛素化作用,从而降低IFN-β的水平。综上所述,MGF360-14L可能通过竞争性结合MAVS,抑制TRIM21对MAVS的泛素化,从而下调Ⅰ型IFN的产生。研究结果为探究ASFV的免疫逃逸机制提供了新线索。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 Ⅰ型干扰素 线粒体抗病毒信号蛋白 泛素化 免疫逃逸
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检测牛IFN-γ双抗体夹心ELISA的建立及在牛结核病诊断上的初步应用 被引量:3
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作者 张改梅 贾红 +9 位作者 侯绍华 鑫婷 郭晓宇 袁维峰 刘淑清 吴竞 高新桃 李明 董瑞凯 朱鸿飞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1693-1698,共6页
本研究旨在建立牛IFN-γ体外释放法,为牛结核病的免疫学诊断提供一种快速、有效的新检测技术。分别以获得的牛IFN-γ单克隆抗体Bo-mAb1作为捕获抗体,以Bo-mAb2H作为检测抗体,建立了基于双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)的牛IFN-γ体外释放法... 本研究旨在建立牛IFN-γ体外释放法,为牛结核病的免疫学诊断提供一种快速、有效的新检测技术。分别以获得的牛IFN-γ单克隆抗体Bo-mAb1作为捕获抗体,以Bo-mAb2H作为检测抗体,建立了基于双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)的牛IFN-γ体外释放法。该方法的最低检出限为3.12ng·mL-1,可特异性检测出重组牛IFN-γ(Bac-BoIFN-γ)及天然BoIFN-γ,而与猪、犬、鸡的天然IFN-γ无交叉反应。批内、批间变异系数小于5.11%。临床检测结果显示,与结核菌素皮内变态试验(TST)、进口BovigamTM试剂盒检测的符合率分别为88.7%和95.3%。结果表明,DAS-ELISA法具有良好的敏感性、特异性及精确度,可用于临床样品的检测,为监测牛结核病特别是其早期感染提供了强有力的检测技术手段。 展开更多
关键词 牛结核病 IFN-Γ 双抗体夹心ELISA 临床诊断
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济南市犬瘟热病毒H基因遗传进化分析 被引量:4
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作者 王召阳 蒋亚君 +5 位作者 刘雪婷 侯绍华 郭晓宇 鑫婷 朱鸿飞 贾红 《动物医学进展》 北大核心 2021年第1期6-12,共7页
为了解济南市犬瘟热病毒(CDV)的流行情况,通过随机采集7份济南市2019年1月-6月份宠物医院疑似感染CDV的临床样品,提取病毒RNA,扩增CDV H基因全长序列,连接至载体,测序后进行H基因序列的氨基酸及核苷酸同源性分析、进化树分析、主要氨基... 为了解济南市犬瘟热病毒(CDV)的流行情况,通过随机采集7份济南市2019年1月-6月份宠物医院疑似感染CDV的临床样品,提取病毒RNA,扩增CDV H基因全长序列,连接至载体,测序后进行H基因序列的氨基酸及核苷酸同源性分析、进化树分析、主要氨基酸位点突变分析以及H基因抗原表位预测分析。结果显示,7个野毒株均为Asia-Ⅰ型,H基因核苷酸同源性为98.7%~99.9%,氨基酸同源性为98.7%~100%,与疫苗株相比差异较大,核苷酸、氨基酸同源性分别为90.0%~90.9%和88.8%~91.4%。主要氨基酸位点突变分析表明,除SD-07为8个潜在天冬酰胺糖基化位点,其余6株均为9个潜在天冬酰胺糖基化位点。H基因抗原性预测分析表明,7个野毒株与疫苗株相比存在明显的差异。研究结果表明,济南市犬瘟热病毒株以Asia-Ⅰ型为主,野毒株同源性与疫苗株相比差异较大,不同毒株间存在遗传多样性。 展开更多
关键词 犬瘟热 犬瘟热病毒 H基因 序列分析
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2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病性分析 被引量:4
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作者 李志 隋修锟 +5 位作者 吴竞 鑫婷 李明 高新桃 姜一曈 侯绍华 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第5期1477-1483,共7页
为追踪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分离株的变异特点,本研究于2016年从河北和福建疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)发病猪场采集病料,接种Marc-145细胞,产生合胞体样细胞病变,... 为追踪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分离株的变异特点,本研究于2016年从河北和福建疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)发病猪场采集病料,接种Marc-145细胞,产生合胞体样细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为HP-PRRSV,将其分别命名为PRRSV CZ16A和NP16A。为研究PRRSV分离株CZ16A和NP16A对猪的致病性,将分离毒株经噬斑纯化后分别接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄健康仔猪,通过临床观察、解剖病理变化及病毒血症检测等指标初步探讨两株PRRSV的致病性。结果表明,分离株CZ16A和NP16A感染猪后均能够在动物体内复制,并引起体温升高,但两株PRRSV分离株均未引起试验动物的发病和死亡,剖检结果显示NP16A分离株能引起动物肺部实变、淋巴结肿大,其毒力比CZ16A分离株稍强。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分离鉴定 致病性分析
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