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小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析 被引量：1
1
作者 王通 郭嘉慧 +3 位作者 陈智鹏 银兴峰 马文心 崔毅峙 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期881-884,共4页
目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with am... 目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM。方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率。结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965。以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个。其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出。统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求。结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段。 展开更多
关键词 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM) SILAC 质谱 标记效率 蛋白质组 定量
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特色生物实验室教学与管理改革探讨 被引量：3
2
作者 贾红玲 洪嫄 +1 位作者 银兴峰 肖传乐 《山西医科大学学报（基础医学教育版）》 2010年第5期521-523,526,共4页
生物实验室是师生进行科学实验和教学活动的重要场所,是完成生物教学任务不可缺少的组成部分。根据生物学科发展特点,结合蛋白组学专业特色,对实验室教学和管理改革进行了探索与实践,为培养具有科研能力与创新精神的高素质人才打下坚实... 生物实验室是师生进行科学实验和教学活动的重要场所,是完成生物教学任务不可缺少的组成部分。根据生物学科发展特点,结合蛋白组学专业特色,对实验室教学和管理改革进行了探索与实践,为培养具有科研能力与创新精神的高素质人才打下坚实的基础。 展开更多
关键词 生物实验室 教学改革 创新
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GST-NDPK-A融合蛋白的原核表达及体外互作蛋白的检测
3
作者 吕芬 刘忠 +6 位作者 银兴峰 赵振岭 陈妙娟 张嘉萱 陈伟 钱垂文 熊盛 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期137-143,共7页
旨在了解核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的功能,通过GST-Pull down技术寻找与其存在体外相互作用的蛋白。以含有目的片段的质粒pBV-NDPK-A为模板,扩增出相应的目的基因片段,将其插入带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达质粒。双... 旨在了解核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的功能,通过GST-Pull down技术寻找与其存在体外相互作用的蛋白。以含有目的片段的质粒pBV-NDPK-A为模板,扩增出相应的目的基因片段,将其插入带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达质粒。双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定融合蛋白的表达,并与高表达细胞系A549孵育,进行GST-Pull down试验,并通过LC-MS/MS质谱鉴定体外与NDPK-A相互作用的蛋白。结果显示,成功构建GST-NDPK-A的原核表达载体;在大肠杆菌BL21中诱导表达出可溶性融合蛋白;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了有生物活性的GST-NDPK-A融合蛋白,GST-Pull down试验和质谱鉴定结果发现NDPK-A与Fussel-18、Rrp12体外存在相互作用。 展开更多
关键词 NDPK-A Fussel-18 Rrp12 表达纯化 相互作用
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白念珠菌对氟康唑耐药的差异性膜蛋白质组学分析 被引量：2
4
作者 张晓利 高来强 +3 位作者 吴喜福 张宏 张革化 银兴峰 《中华皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期262-265,共4页
目的鉴定并分析白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株的差异表达膜蛋白质。方法以同-亲本来源的白念珠菌氟康唑敏感株cA-3和耐药株cA-16为研究对象，以双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D—PAGE）技术分析菌株之间膜蛋白图谱的差异，以基质辅助激光解... 目的鉴定并分析白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株的差异表达膜蛋白质。方法以同-亲本来源的白念珠菌氟康唑敏感株cA-3和耐药株cA-16为研究对象，以双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D—PAGE）技术分析菌株之间膜蛋白图谱的差异，以基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI—TOFr0F—Ms）鉴定表达差异的蛋白质，通过白念珠菌蛋白质数据库进行检索分析。结果白念珠菌氟康唑耐药株较敏感株有22种差异表达蛋白质点，其中有6种蛋白质上调，为Adhlp、csp37p、Pgklp、P醇lp和2个未命名蛋白质（gi227305312、gi53954641）；16种蚕匿白质下调，分别为Ac01p、Ac01p、Hsp78p、Gut2p、sdhl2p、Ilv2p、Ndh51p、Ndh51p、Atplp、Pdalp、srhlp、Idhlp、Tdhlp、cytlp、cox4I）、coxl3p。结论白念珠菌氟康唑耐药株较敏感株差异膜蛋白主要涉及能量代谢、线粒体功能等。 展开更多
关键词 念珠菌 白色 氟康唑 抗药性 真菌 膜蛋白质类 蛋白质组学
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利用固定化金属亲和层析和质谱技术鉴定化脓性链球菌铜结合蛋白 被引量：2
5
作者 贺翔 银兴峰 +2 位作者 张留辉 阳小燕 孙雪松 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1656-1662,共7页
化脓性链球菌是一种常见的高致病性革兰氏阳性菌,每年都在全球范围内引发大量的感染现象与病死案例。金属蛋白在微生物的代谢以及毒性构成中的作用已经逐渐得到重视。通过固定化金属离子亲合层析技术对化脓性链球菌中铜结合蛋白进行分离... 化脓性链球菌是一种常见的高致病性革兰氏阳性菌,每年都在全球范围内引发大量的感染现象与病死案例。金属蛋白在微生物的代谢以及毒性构成中的作用已经逐渐得到重视。通过固定化金属离子亲合层析技术对化脓性链球菌中铜结合蛋白进行分离,配合质谱技术的使用,共鉴定出21个铜结合蛋白,这些蛋白分别在翻译、代谢、离子通道等各个生理进程中发挥相应作用。 展开更多
关键词 化脓性链球菌 IMAC 金属蛋白 铜结合蛋白
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D-半乳糖致衰老小鼠与幼龄小鼠的垂体差异蛋白质分析 被引量：1
6
作者 曹锐 银兴峰 +5 位作者 李江林 谢纯良 王迎 王贤纯 陈平 梁宋平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期248-253,共6页
脑垂体是控制动物生长发育衰老死亡非常重要的一个器官.随着机体的衰老,垂体功能退化是必然趋势.D-半乳糖致衰老模型已被广泛用于研究衰老机制和筛选药物靶标,然而其分子机制尚未清楚.本研究采用差异蛋白质组学方法,以寻找D-半乳糖致衰... 脑垂体是控制动物生长发育衰老死亡非常重要的一个器官.随着机体的衰老,垂体功能退化是必然趋势.D-半乳糖致衰老模型已被广泛用于研究衰老机制和筛选药物靶标,然而其分子机制尚未清楚.本研究采用差异蛋白质组学方法,以寻找D-半乳糖致衰老小鼠和幼龄小鼠垂体的差异蛋白质,为弄清其功能障碍的分子机制提供新的研究方法和线索.基于双相电泳和质谱结合的方法,本研究发现了46个大于2倍的差异蛋白质,其中32个得到可靠的鉴定(P<0.05).对差异蛋白质功能分析发现,这些显著差异蛋白质主要分布于糖代谢通路,可能与线粒体功能紊乱有关.我们的研究数据为更好地理解D-半乳糖致衰老小鼠垂体功能障碍的内在机制提供了线索. 展开更多
关键词 垂体 D-半乳糖 衰老 糖代谢 蛋白质组学 质谱
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鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估 被引量：1
7
作者 陈平 张丽军 +9 位作者 李选文 王细娥 曹锐 刘珍 熊继先 彭霞 魏颖娟 银兴峰 王贤纯 梁宋平 《中国科学（C辑）》 CSCD 北大核心 2007年第6期601-608,共8页
细胞质膜是细胞中重要的细胞器,在肝功能的发挥中具有非常重要的作用.使用蔗糖密度梯度离心纯化细胞质膜,通过电子显微镜观察和免疫印迹法检验膜的纯度.结果显示,与组织匀浆成分相比,质膜富集了20倍,线粒体的污染减少了约50%.提取的蛋... 细胞质膜是细胞中重要的细胞器,在肝功能的发挥中具有非常重要的作用.使用蔗糖密度梯度离心纯化细胞质膜,通过电子显微镜观察和免疫印迹法检验膜的纯度.结果显示,与组织匀浆成分相比,质膜富集了20倍,线粒体的污染减少了约50%.提取的蛋白质用二/一维凝胶电泳(2DE/1DE)分离、胰酶酶解、电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定,或者提取的蛋白质直接进行溶液内酶解、液相色谱串联电喷雾离子阱质谱(LC-LTQ)(鸟枪法)鉴定.一共鉴定了547个非冗余蛋白质,其中34%为质膜或质膜相关蛋白质.优化和评估了质膜蛋白质组研究的方法,且对鼠肝质膜蛋白质组进行了系统的分析. 展开更多
关键词 肝 细胞质膜 蛋白质组 质谱 2DE 鸟枪法 1DE
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光谱法结合分子对接研究普罗帕酮与牛血清白蛋白的相互作用 被引量：6
8
作者 李楠 曾观娣 +1 位作者 孙正华 银兴峰 《分析试验室》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期1148-1154,共7页
综合运用圆二色谱、停留-动力学、荧光、同步荧光、三维荧光、等温量热滴定法(ITC)等技术并结合分子对接进行表征牛血清白蛋白(BSA)与普罗帕酮的结合热力学及结合动力学参数。研究结果表明,BSA对普罗帕酮结合特异,在291K,298K,310K二者... 综合运用圆二色谱、停留-动力学、荧光、同步荧光、三维荧光、等温量热滴定法(ITC)等技术并结合分子对接进行表征牛血清白蛋白(BSA)与普罗帕酮的结合热力学及结合动力学参数。研究结果表明,BSA对普罗帕酮结合特异,在291K,298K,310K二者的亲和常数分别是2.612×105,2.879×105,6.793×105mol^-1,结合位点数n约为1。同步荧光光谱及三维荧光光谱表明,普罗帕酮与BSA结合后,荧光光谱发生蓝移,揭示BSA结合药物分子后高级构象发生变化。BSA结合普罗帕酮的停留-动力学反应符合三级指数方程曲线,快反应在约0.03 s完成结合,结合速率常数k1=0.097!0.02 s^-1,k2=1.058!0.18 s^-1,k3=31.410!1.18 s^-1。进一步通过分子对接显示普罗帕酮结合在蛋白的I域的IB疏水性口袋中,有12个氨基酸残基参与配体结合,其中Tyr160与Phe13各提供1个氢键参与配体结合,而带电氨基酸Glu125,Lys136,Arg185紧紧把配体束缚在结合口袋中。研究工作将有助于在分子水平上更为详细了解普罗帕酮与BSA的相互作用,并为进一步了解普罗帕酮在生物体内的作用提供理论基础。 展开更多
关键词 普罗帕酮 圆二色谱 荧光光谱 停留-动力学 分子对接
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利用IMAC与LC-MS/MS技术分离和鉴定化脓链球菌中的锌结合蛋白
9
作者 阳小燕 银兴峰 +2 位作者 张留辉 贺翔 孙雪松 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期30-37,共8页
化脓链球菌是一种革兰氏阳性致病菌,能引起一系列疾病。运用固定化金属离子亲和层析技术(IMAC)富集化脓链球菌中锌结合蛋白,进行溶液酶解,利用先进的LC-MS/MS技术对富集的锌结合蛋白进行质谱分析。鉴定到48个在化脓链球菌中与锌结合相... 化脓链球菌是一种革兰氏阳性致病菌,能引起一系列疾病。运用固定化金属离子亲和层析技术(IMAC)富集化脓链球菌中锌结合蛋白,进行溶液酶解,利用先进的LC-MS/MS技术对富集的锌结合蛋白进行质谱分析。鉴定到48个在化脓链球菌中与锌结合相关蛋白,这些蛋白主要涉及到蛋白翻译、糖代谢、金属转运、氧化等重要生理过程。这些结果对于深入研究化脓链球菌的致病机制,寻找新的抗菌药物作用靶点和疫苗候选物具有重要意义。 展开更多
关键词 LC—MS/MS 化脓链球菌 锌结合蛋白 IMAC
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孵育时间在二氧化钛选择性富集磷酸化肽中的影响
10
作者 詹胜 银兴峰 +3 位作者 李慧 李楠 阳小燕 孙雪松 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期59-62,共4页
目的:旨在探索孵育时间在二氧化钛选择性富集磷酸化肽中的影响。方法:以大肠杆菌BL21(DE3)为材料,预实验确定二氧化钛磁珠与肽段之间的最适比例,之后在此比例下继续探究不同孵育时间条件下的富集效果,以观察孵育时间在二氧化钛富集体系... 目的:旨在探索孵育时间在二氧化钛选择性富集磷酸化肽中的影响。方法:以大肠杆菌BL21(DE3)为材料,预实验确定二氧化钛磁珠与肽段之间的最适比例,之后在此比例下继续探究不同孵育时间条件下的富集效果,以观察孵育时间在二氧化钛富集体系中的影响。结果:预实验确定磁珠与肽段之间最适比例为3∶1,在此比例下发现随着孵育时间的增加其富集效率会逐渐降低,最后确定大肠杆菌中最适孵育时间为5min。结论:孵育时间在大肠杆菌二氧化钛富集体系中对富集效果有明显的影响,并且呈负相关。推测不同样品的最佳孵育时间与样品种属有关。 展开更多
关键词 二氧化钛 磷酸化 孵育时间 大肠杆菌
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