树鼩γ干扰素在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性鉴定 被引量：2

1

作者 丁晨 肖红剑 +6 位作者 龙琼 李智华 毕研伟 闫玲梅 李育中 姚月婷 寸韡 《生物技术通讯》 CAS 2018年第3期377-381,共5页

目的:克隆树鼩γ干扰素(IFNγ)基因,在大肠杆菌中高效表达纯化并鉴定其免疫原性。方法:提取树鼩肺组织总RNA,经RT-PCR扩增出树鼩IFNγ基因,再克隆到原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感... 目的:克隆树鼩γ干扰素(IFNγ)基因,在大肠杆菌中高效表达纯化并鉴定其免疫原性。方法:提取树鼩肺组织总RNA,经RT-PCR扩增出树鼩IFNγ基因,再克隆到原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩IFNγ;经金属螯合柱复性及纯化,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IFNγ的分布情况。结果:构建了重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,重组蛋白在30℃、1 mmol/L IPTG诱导4 h获得较高表达量,镍柱复性纯化后得到较高纯度的树鼩IFNγ。Western印迹显示IFNγ可与兔抗人IFNγ单克隆抗体特异性结合,应用Western印迹和ELISA分别检测树鼩IFNγ的免疫原性和抗体滴度,在树鼩的鼻、心、肝、肺、肾、气管中检测到IFNγ。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IFNγ,复性纯化后具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 树鼩 Γ干扰素 原核表达 亲和层析 免疫原性

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金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达及活性鉴定 被引量：1

2

作者 丁晨 张辉 +7 位作者 肖红剑 李智华 毕研伟 李育中 闫玲梅 龙琼 姚月婷 寸韡 《生物技术通讯》 CAS 2017年第6期750-755,共6页

目的:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为基础,在枯草芽孢杆菌中得到具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到SplB基因,同源重组到表达载体pHTSHIS上,再转化枯草芽孢杆菌;优化诱导条... 目的:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为基础,在枯草芽孢杆菌中得到具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到SplB基因,同源重组到表达载体pHTSHIS上,再转化枯草芽孢杆菌;优化诱导条件发酵枯草芽孢杆菌,离心后超滤浓缩上清液,再经镍柱分离纯化;利用SDS-PAGE、Lowry法对蛋白的相对分子质量、浓度等进行分析,对蛋白的酶切活性进行鉴定。结果:金黄色葡萄球菌基因组DNA经PCR扩增得到与预计大小相符的DNA片段,通过同源重组构建了表达载体pHTS-SplB-His;选取诱导前菌液D_(600nm)为2.0、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导4 h的最优条件发酵枯草芽孢杆菌,表达大量金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B;蛋白浓缩后,经镍柱分离纯化得到纯度较高且具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。结论:采用枯草芽孢杆菌进行发酵表达,可提高金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达量,并且能够得到具有剪切功能的蛋白。本研究可为外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的发酵技术提供重要参考。 展开更多

关键词 丝氨酸类蛋白酶B 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 分泌表达 亲和层析

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开发型研究所开展思想政治工作和文化建设的探索 被引量：2

3

作者 吴俊 闫玲梅 +1 位作者 赵远 游丹 《科技创业月刊》 2013年第6期11-12,共2页

随着国有事业单位改革的不断深入与发展,文化建设已成为一种潜在的资源和发展的动力,其重要性越来越引起社会各界的关注与重视。在新形势下,如何有效开展思想政治工作,营造积极健康的研究所文化氛围,并使两者相互促进、有机结合,以更好... 随着国有事业单位改革的不断深入与发展,文化建设已成为一种潜在的资源和发展的动力,其重要性越来越引起社会各界的关注与重视。在新形势下,如何有效开展思想政治工作,营造积极健康的研究所文化氛围,并使两者相互促进、有机结合,以更好地推动开发型研究所持续健康发展,已成为科研院所思想政治工作面临的一项重要任务。 展开更多

关键词 思想政治工作 文化建设 相互促进 融合 持续健康发展

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幽门螺杆菌oipA基因的克隆及其生物信息学分析

4

作者 陈阳 李健峰 +3 位作者 姬秋彦 闫玲梅 龙海亭 徐维明 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第7期867-870,共4页

目的:克隆幽门螺杆菌(Helicobacterprlori,Hpylori)前炎症外膜蛋白基因oipA,并对其进行生物信息学分析.方法:利用GenBank已公布序列设计引物,用PCK进行扩增后,酶切,连入载体pGEX-5X-1,并进行序列测定.用数据库Blast,NCBICDD,Swiss—mode... 目的:克隆幽门螺杆菌(Helicobacterprlori,Hpylori)前炎症外膜蛋白基因oipA,并对其进行生物信息学分析.方法:利用GenBank已公布序列设计引物,用PCK进行扩增后,酶切,连入载体pGEX-5X-1,并进行序列测定.用数据库Blast,NCBICDD,Swiss—model,Propred以及生物学软件Omigav2.0和Antheprotv5.0分析其生物学特性.结果:克隆片段与GenBank公布序列完全一致.经Blast比对未发现与oipA同源的其他种属基因,通过NCBICDD未找到已知保守区域和oipA编码氨基酸序列相关.应用Omigav2.0,Antheprotv5.0软件预测显示该蛋白具有良好的疏水性和抗原性,将该分析结果和Propred结果比对得到预测的抗原表位.结论:应用生物信息学技术,对幽门螺杆菌基因oipA进行分析,将为Hpylori与相关致病发生机制研究,Hpy-lori疫苗的开发等工作奠定一定基础. 展开更多

关键词 生物信息学分析 幽门螺杆菌 克隆 HPYLORI A基因 生物信息学技术 OIPA 外膜蛋白基因 NCBI 生物学特性 设计引物 序列测定 序列相关 抗原表位 分析结果 机制研究 CDD PCR 数据库 未发现 氨基酸 抗原性 疏水性 软件 预测

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树鼩白细胞介素6的原核表达、纯化及免疫原性鉴定

5

作者 龙琼 徐盟 +8 位作者 郝嘉茂 毕研伟 肖红剑 李智华 闫玲梅 丁晨 李育中 姚月婷 寸韡 《生物技术通讯》 CAS 2017年第6期768-772,共5页

目的:克隆树鼩白细胞介素6(IL-6)基因,在大肠杆菌中高效表达、纯化,并鉴定免疫原性。方法:根据GenBank预测的树鼩IL-6基因序列设计引物并扩增基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建的重组表达质粒pET-30a(+)-IL-6转化大肠杆菌BL21,IPT... 目的:克隆树鼩白细胞介素6(IL-6)基因,在大肠杆菌中高效表达、纯化,并鉴定免疫原性。方法:根据GenBank预测的树鼩IL-6基因序列设计引物并扩增基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建的重组表达质粒pET-30a(+)-IL-6转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达;表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IL-6的分布情况。结果:酶切及测序证实重组表达质粒pET-30a(+)-IL-6构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29×10~3,纯化后复性的重组蛋白纯度可达95%以上,免疫兔子后Western印迹和ELISA鉴定其具有免疫原性,在气管、心、脾、肾中能检测到IL-6。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IL-6,纯化复性后具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 树鼩 白细胞介素-6 原核表达 纯化 免疫原性

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分光光度法标定酵母超滤液浓度及其在脑膜炎球菌培养基优化过程中的应用

6

作者 毕研伟 肖红剑 +2 位作者 丁晨 闫玲梅 寸韡 《生物技术通讯》 CAS 2017年第2期118-122,共5页

目的:建立检测酵母超滤液浓度的方法,并探索适合A、C群脑膜炎球菌生长的无动物源性培养基中酵母超滤液的浓度。方法:通过全波长扫描及不同波长吸光度值的比较确定检测酵母提取物浓度的最佳波长;用3000 Da超滤膜超滤酵母提取物溶液,制备... 目的:建立检测酵母超滤液浓度的方法,并探索适合A、C群脑膜炎球菌生长的无动物源性培养基中酵母超滤液的浓度。方法:通过全波长扫描及不同波长吸光度值的比较确定检测酵母提取物浓度的最佳波长;用3000 Da超滤膜超滤酵母提取物溶液,制备酵母超滤液并检测其性质;观察脑膜炎球菌在含不同批次酵母超滤液的半综合培养基中的生长情况,验证不同批次标化的酵母超滤液的稳定性;配制含不同浓度酵母超滤液的半综合液体培养基,观察A、C群脑膜炎球菌的生长情况。结果:通过全波长扫描及不同波长吸光度值的比较,确定了检测酵母提取物浓度的最佳波长为405 nm;采用3000 Da超滤膜超滤后的酵母超滤液不与CTAB产生沉淀,通过检测其D_(405nm)值,可以确定酵母超滤液的浓度;从生长情况考虑,A、C群脑膜炎球菌半综合培养基中最优酵母超滤液浓度分别为4、2 mg/L。结论:建立了制备酵母超滤液及分光光度法标定酵母超滤液浓度的方法,确定了培养A、C群脑膜炎球菌半综合培养基中最优酵母超滤液浓度。 展开更多

关键词 酵母提取物 分光光度法 酵母超滤液 脑膜炎球菌

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TritonX-114残留量检测方法的建立及验证 被引量：3

7

作者 李育中 毕研伟 +2 位作者 闫玲梅 肖红剑 寸韡 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第11期1187-1192,共6页

目的建立测定生物制品中Triton X-114残留量的方法,并进行验证及初步应用。方法先对Triton X-114进行光谱扫描,用所得到的特异吸收峰来初步检测Triton X-114的残留量,再根据Triton X-114与苯酚发生反应并产生具有一定浊度的复合物,且浊... 目的建立测定生物制品中Triton X-114残留量的方法,并进行验证及初步应用。方法先对Triton X-114进行光谱扫描,用所得到的特异吸收峰来初步检测Triton X-114的残留量,再根据Triton X-114与苯酚发生反应并产生具有一定浊度的复合物,且浊度与Triton X-114的浓度成正比的原理,通过测定340 nm处吸光度值,建立测定Triton X-114残留量的方法,并对方法进行稳定性、准确性、精密性验证。考察核酸和蛋白对Triton X-114含量测定的影响,并分别采用紫外吸光法和建立的方法检测样品中的Triton X-114含量。结果 Triton X-114在280 nm左右有特异吸收峰,可通过测定280 nm处的吸光度值来初步测定Triton X-114的残留量;利用Triton X-114与苯酚发生反应后产物的A340值来测定Triton X-114含量的方法的线性范围为0.001%~0.007%,检测下限为0.001%;建立标准曲线后,每间隔5 min测定1次A340值,各浓度标准品A340值的变异系数（CV）均小于5%;低（0.001%）、中（0.003%）、高（0.006%）浓度Triton X-114溶液连续测定3次,每个浓度平行测定9组的CV值均〈5%,回收率均〉100%;核酸和蛋白对该方法测定Triton X-114的含量无影响;4份样品经两种方法检测的试验内CV值均〈10%。结论可采用280 nm紫外吸收法初步测定Triton X-114的含量,但该法灵敏度低,易受干扰;而采用Triton X-114与苯酚反应后检测其产物浊度的方法来测定Triton X-114的残留量,稳定性、精密性良好,准确性高,可用于生物制品中Triton X-114残留量的检测。 展开更多

关键词 TRITON X-114 残留量 生物制品

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重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定 被引量：2

8

作者 姬秋彦 毕研伟 +3 位作者 肖红剑 闫玲梅 高丹丹 李智华 《云南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第S2期426-431,共6页

应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚... 应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶. 展开更多

关键词 重组肠激酶 分泌表达 高密度发酵 阳离子交换层析 融合蛋白切割

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人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化 被引量：1

9

作者 彭正华 蔡路奎 +6 位作者 姬秋彦 毕研伟 罗娜 肖红剑 闫玲梅 高丹丹 李智华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第2期155-159,共5页

目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHis... 目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 呼吸道合胞病毒 人 F1蛋白 基因表达 纯化 免疫原性

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树鼩干细胞生长因子的原核表达、纯化及免疫原性 被引量：1

10

作者 龙琼 郝嘉茂 +8 位作者 徐盟 毕研伟 肖红剑 李智华 闫玲梅 丁晨 李育中 姚月婷 寸韡 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期20-24,28,共6页

目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL2... 目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,免疫家兔,Western blot和ELISA法检测其免疫原性,并检测SCF在树鼩不同组织中的分布情况。结果重组表达质粒pET-30a(+)-SCF经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为34 500,表达量约占菌体总蛋白的35. 6%,以包涵体形式存在;纯化后的重组蛋白纯度达90%以上,可与兔抗人SCF多克隆抗体特异性结合,且免疫原性良好,抗血清效价为1∶256 000。在鼻、气管、肺、脾、肾、食管中能检测到SCF的分布。结论在大肠埃希菌中高效表达了重组SCF蛋白,纯化复性后具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 树鼩 干细胞生长因子 原核表达 纯化 免疫原性

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3种方法提取的B群脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡组分的免疫原性、毒性及杀菌活性 被引量：3

11

作者 李晓晶 高丹丹 +6 位作者 毕研伟 姬秋彦 闫玲梅 戴宗祥 李健峰 李智华 徐维明 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第10期1183-1186,共4页

目的采用3种方法提取B群脑膜炎奈瑟菌(Serogroup B Neisseria meningitidis,MenB)的外膜囊泡(Outer mem-brane vesicle,OMV),并分析其免疫原性、毒性和杀菌活性。方法分别采用去污剂+EDTA、EDTA、从培养上清液中离心提取3种方法获得MenB... 目的采用3种方法提取B群脑膜炎奈瑟菌(Serogroup B Neisseria meningitidis,MenB)的外膜囊泡(Outer mem-brane vesicle,OMV),并分析其免疫原性、毒性和杀菌活性。方法分别采用去污剂+EDTA、EDTA、从培养上清液中离心提取3种方法获得MenB的OMV,即dOMV、nOMV和sOMV,SDS-PAGE分析OMV主要蛋白组分,Lowry法测定蛋白浓度,LAL试验测定内毒素含量。将3种OMV免疫小鼠,采用ELISA法测定小鼠血清中IgG抗体滴度,杀菌力试验测定3种OMV诱导针对MenB补体依赖的杀菌反应。结果 dOMV、nOMV和sOMV的主要蛋白成分基本一致,内毒素含量分别为5.0×103、7.5×104和4.0×106 EU/mg,产率分别为11.640、10.210和4.135μg/1010个细菌;dOMV、nOMV和sOMV组小鼠血清抗体滴度分为3.98×106、2.51×107和5.62×104,与阴性对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),杀菌抗体滴度分别为501.70、697.11和55.39。结论用3种不同的方法成功制备了3种MenB的OMV,并对其免疫原性、毒性和杀菌活性进行了比较,为研发B群脑膜炎OMV疫苗提供了理论依据。 展开更多

关键词 奈瑟球菌 脑膜炎 血清B群 外膜囊泡 疫苗

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