人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定 被引量：4

1

作者 闭兰 张爱华 +4 位作者 孙可芳 胡巧玲 祝玉桃 王志友 余模松 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第6期445-447,共3页

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,... 目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。 展开更多

关键词 人源抗狂犬病毒G蛋白 单链抗体 基因表达 鉴定方法 可溶性表达

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从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体 被引量：4

2

作者 闭兰 张爱华 +3 位作者 彭祥兵 王志友 张智 余模松 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2004年第2期65-67,共3页

目的　应用纯化的狂犬病毒抗原从半合成噬菌体抗体库中筛选针对狂犬病毒的人单链抗体(ScFv)。方法　用固相化的狂犬病毒抗原对半合成抗体库进行 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,从第 3轮洗脱下来的克隆中获得一株有可溶性表达且特异性... 目的　应用纯化的狂犬病毒抗原从半合成噬菌体抗体库中筛选针对狂犬病毒的人单链抗体(ScFv)。方法　用固相化的狂犬病毒抗原对半合成抗体库进行 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,从第 3轮洗脱下来的克隆中获得一株有可溶性表达且特异性结合狂犬病毒抗原的ScFv ,并进行基因序列测定。结果　所获氨基酸序列经blast数据库搜索 ,与一种抗狂犬病毒免疫球蛋白的氨基酸序列同源性最高 ( 82 % )。经检索kabat数据库 ,发现其轻、重链可变区分别属于VkⅠ型、VHⅢ型。结论　从噬菌体抗体库可以方便快捷地分离到针对狂犬病毒的单链抗体 。 展开更多

关键词 狂犬病毒 人单链抗体 噬菌体抗体库 预防 免疫球蛋白

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人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的生物学鉴定及其小鼠体内中和活性测定 被引量：3

3

作者 闭兰 朱蓉 +4 位作者 张爱华 孙可芳 赵亚杰 王志友 余模松 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第5期397-399,共3页

目的对从噬菌体抗体库中筛选的人源抗狂犬病毒单链抗体A12进行生物学活性鉴定及小鼠体内中和活性检测。方法用免疫荧光法检测其结合感染狂犬病毒CVS的鼠脑组织的能力,用小鼠中和实验测定A12表达产物的体内中和活性。结果免疫荧光试验显... 目的对从噬菌体抗体库中筛选的人源抗狂犬病毒单链抗体A12进行生物学活性鉴定及小鼠体内中和活性检测。方法用免疫荧光法检测其结合感染狂犬病毒CVS的鼠脑组织的能力,用小鼠中和实验测定A12表达产物的体内中和活性。结果免疫荧光试验显示A12表达产物与感染CVS的鼠脑细胞有强的荧光反应。小鼠中和试验结果表明,A12ScFv样品组小鼠有9只存活,而对照组小鼠全部死亡。A12在729倍稀释时能100%保护小鼠抵抗致死量狂犬病毒的脑内攻击。结论A12对狂犬病毒具有一定的中和活性,有可能被用于暴露后狂犬病的预防。 展开更多

关键词 单链抗体 狂犬病毒G蛋白 免疫荧光反应 小鼠体内中和实验

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抗体工程研究进展 被引量：3

4

作者 闭兰 余模松 《微生物学免疫学进展》 2006年第1期46-49,共4页

噬菌体抗体库技术的出现为抗体工程的研究带来了革命性的变化,本文总结了当前国内外抗体工程,特别是单链抗体方面的研究进展。

关键词 噬菌体抗体库 抗体工程 单链抗体

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HIV-1 gp41基因的高效表达及表达产物的纯化

5

作者 闭兰 雷小军 +3 位作者 陈伟 严家新 余模松 朱家鸿 《中国病毒学》 CSCD 1998年第4期340-344,共5页

为了获得高效表达的人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ１）ｇｐ４１蛋白，从而为ＨＩＶ１基因工程诊断抗原的国产化打下基础，用ＰＣＲ的方法从ＨＩＶ１全基因序列中扩增出编码ｇｐ４１Ｎ端的６９０ｂｐ片段。经酶切后，克隆到ｐＥＴ２８... 为了获得高效表达的人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ１）ｇｐ４１蛋白，从而为ＨＩＶ１基因工程诊断抗原的国产化打下基础，用ＰＣＲ的方法从ＨＩＶ１全基因序列中扩增出编码ｇｐ４１Ｎ端的６９０ｂｐ片段。经酶切后，克隆到ｐＥＴ２８ａ载体中，再将重组质粒转化到表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导，高效表达出ｇｐ４１蛋白。间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＳＤＳＰＡＧＥ电泳证实，该表达产物具有良好的抗原性和特异性，且表达量约占总菌体蛋白的４５％。重组蛋白经金属鏊合纯化，纯度达９９％。 展开更多

关键词 人免疫缺陷病毒 gp41基因 pET载体 高效表达

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抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定 被引量：3

6

作者 张爱华 彭夫望 +3 位作者 闭兰 张智 王志友 史良如 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第2期81-84,共4页

目的　利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法　从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变... 目的　利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法　从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果　构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论　经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。 展开更多

关键词 单链抗体基因 CD71 抗C 临床应用 小鼠 转铁蛋白受体 单克隆抗体 重叠PCR 诱导表达 表达载体

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HIV-1型衣壳蛋白P24在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定 被引量：4

7

作者 陈伟 张为 +3 位作者 李茜 朱华松 闭兰 余模松 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 1999年第1期8-11,共4页

用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4... 用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4在间接 EL ISA和免疫印迹中表现出很高的抗原特异性和免疫反应性。 展开更多

关键词 HIV-1 P24 大肠杆菌 表达

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抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定 被引量：3

8

作者 沈弢 张爱华 +1 位作者 闭兰 史良如 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期264-266,共3页

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因... 目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv基因连接到pBAD/gⅢA表达载体,转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果:scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser)。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类,全长351 bp,可编码117个氨基酸;其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,全长318 bp,可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-mycMr约为31 000,结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。 展开更多

关键词 CD25 SCFV 蛋白表达 ELISA

原文传递

采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库 被引量：2

9

作者 张爱华 闭兰 +6 位作者 端义坤 张智 赵亚杰 孙可芳 闫莹 王志友 余模松 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2004年第5期257-260,共4页

目的　构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法　从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度 (1:10 2 4 )的人全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经RT PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区 ,再以噬菌体质粒为模板分别扩增... 目的　构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法　从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度 (1:10 2 4 )的人全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经RT PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区 ,再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区 (Cκ)和重链恒定区 (CH1) ,将轻链可变区和轻链恒定区 (Cκ)及重链可变区和重链恒定区 (CH1)进行第 1次基因拼接 ,分别形成κ轻链和Fd重链 ,再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第 2次基因拼接 ,形成完整的Fab基因 ,与pComb3H SS噬菌体质粒连接后 ,电穿孔转化大肠杆菌XL1 Blue。结果　通过多次电穿孔转化 ,获得总容量为 4× 10 5库容的噬菌体抗体库。 展开更多

关键词 基因拼接 乙型肝炎病毒 表面抗原 噬菌体抗体库

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抑制mll-af9融合基因表达对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响 被引量：2

10

作者 李蕾 张爱华 +4 位作者 刘凌波 闭兰 王利 赵亚杰 邹萍 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2008年第2期254-257,共4页

本研究探讨siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的mll-af9融合基因的影响。选择THP-1细胞特有的mll-af9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段。以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染... 本研究探讨siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的mll-af9融合基因的影响。选择THP-1细胞特有的mll-af9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段。以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,用RT-PCR法比较转染前后mll-af9 mRNA表达水平的变化,以MTT法检测细胞增生抑制率,流式细胞术检测细胞周期的改变和细胞凋亡水平。结果表明:siRNA转染效率为(69.1±1.8)%,转染siRNA后THP-1细胞生长受到明显抑制,mll-af9融合基因表达量大幅度减少,细胞周期发生了明显的变化,主要表现为G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡水平增高,而对照组siRNA转染后则无上述改变。结论:利用siRNA靶向干扰mll-af9融合基因的表达可以有效抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1的增殖。 展开更多

关键词 siRNA mll—af9 急性单核细胞白血病 THP-1细胞

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人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定 被引量：1

11

作者 黄仕和 周志军 +5 位作者 彭祥兵 詹骞 张爱华 闭兰 余模松 梁米芳 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第12期873-876,共4页

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板... 目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析。结果上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%。经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体。CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%。结论人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒表面抗原 IgG 基因工程抗体 杆状病毒 表达 纯化

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CD25抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析 被引量：1

12

作者 左建民 王志友 +5 位作者 张囡 张爱华 闭兰 陈明洁 陈敬 余模松 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2001年第3期129-131,共3页

目的 获得抗人ＣＤ２５分子单抗的轻链及重链可变区基因，并进行序列分析。方法 采用ＲＴ－ ＰＣＲ，从ＷｕＴａｃ细胞总ＲＮＡ中扩增出轻链、重链可变区基因，进行克隆并作核苷酸序列分析。结果　构建的ＰＭＤ１８ －Ｔ－ＶＬ和ＰＭＤ... 目的 获得抗人ＣＤ２５分子单抗的轻链及重链可变区基因，并进行序列分析。方法 采用ＲＴ－ ＰＣＲ，从ＷｕＴａｃ细胞总ＲＮＡ中扩增出轻链、重链可变区基因，进行克隆并作核苷酸序列分析。结果　构建的ＰＭＤ１８ －Ｔ－ＶＬ和ＰＭＤ１８－Ｔ－ＶＨ重组克隆载体，酶切与预期结果相符。ＶＨ和ＶＬ基因序列与鼠抗体的同源性大于 ８０％。克隆的重链可变区基因长度为３５１ｂｐ，属于鼠重链Ⅲ（Ｃ）亚类。轻链可变区基因长度为３２４ｂｐ，属于鼠轻链 Ⅳ 亚类。结论 本研究采用ＲＴ－ＰＣＴ法扩增出轻链及重链可变区基因，并进行了序列测定和分析，为进一步构建嵌 合抗体以及单链抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 CD25 鼠抗体可变区基因 克隆 序列分析 聚合酶链反应

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防龋DNA疫苗免疫效能评价中间接ELISA检测的建立和验证 被引量：1

13

作者 李宇红 吴小丽 +2 位作者 闭兰 郭长福 张爱华 《口腔医学研究》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期741-743,748,共4页

目的:建立血清样本特异性抗体检测的间接ELISA方法,应用于龋齿DNA疫苗特异性抗体效力检测。方法:通过棋盘滴定确定样本检测条件建立血清特异性抗PAc抗体间接ELISA方法,并对所建立的方法进行特异性和精密度验证。结果:确定包被PAc蛋白浓... 目的:建立血清样本特异性抗体检测的间接ELISA方法,应用于龋齿DNA疫苗特异性抗体效力检测。方法:通过棋盘滴定确定样本检测条件建立血清特异性抗PAc抗体间接ELISA方法,并对所建立的方法进行特异性和精密度验证。结果:确定包被PAc蛋白浓度为10mg/L,酶标抗体工作浓度1∶5000,样本稀释倍数1∶200。方法的重复性检测表明,板间和板内误差小于15%;中间精密度高、中、低3个浓度的CV值小于15%。结论:该方法特异性强,具有良好的重复性和中间精密度,可用于防龋DNA疫苗免疫效能评价中血清样本特异性抗PAc抗体的检测。 展开更多

关键词 防龋DNA疫苗 间接ELISA PAc蛋白 免疫

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抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建 被引量：1

14

作者 黄仕和 彭祥兵 +5 位作者 张爱华 闭兰 余键 周志军 余模松 梁米芳 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第3期170-173,共4页

目的构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,... 目的构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析。确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达。结果PCR扩增的片段约650bp,与预期值一致。载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致。转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应。结论已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒表面抗原 基因工程抗体 杆状病毒

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鼠抗CD71单抗轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析 被引量：1

15

作者 王志友 沈弢 +5 位作者 张爱华 闭兰 金玉铃 孙可芳 余模松 史良如 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第5期409-411,共3页

目的 获得鼠抗人CD71分子单抗的轻链及重链可变区基因。方法 用一步法提取总RNA,逆转录形成cDNA,设计并合成一套扩增小鼠重、轻链可变区的通用引物,通过PCR扩增基因．分别克隆人pMD18－T载体中,作核苷酸序列分析。结果用重链引物扩增获... 目的 获得鼠抗人CD71分子单抗的轻链及重链可变区基因。方法 用一步法提取总RNA,逆转录形成cDNA,设计并合成一套扩增小鼠重、轻链可变区的通用引物,通过PCR扩增基因．分别克隆人pMD18－T载体中,作核苷酸序列分析。结果用重链引物扩增获得长约350bp的片段,用轻链引物扩增获得长约330bp的片段,序列测定获得它们的DNA序列。结论克隆的重链可变区基因长度为348bp,属于小鼠H链可变区IA亚组;克隆的轻链可变区基因长度为336bp,属于小鼠K轻链可变区Ⅱ亚组。 展开更多

关键词 CD71 抗体 可变区基因 单克隆抗体 序列分析 动物实验

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鼠抗CD4抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析 被引量：1

16

作者 王志友 张爱华 闭兰 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期251-253,共3页

为获得鼠抗人 T细胞分化抗原 4分子单抗的轻链及重链可变区基因。采用 RT- PCR技术 ,从 Wu T4细胞总RNA中扩增出轻链和重链可变区基因 ,进行克隆并作核苷酸序列分析 ,发现 RT- PCR扩增出来的两条轻链和一条重链可变区基因分别为 4 0 0 b... 为获得鼠抗人 T细胞分化抗原 4分子单抗的轻链及重链可变区基因。采用 RT- PCR技术 ,从 Wu T4细胞总RNA中扩增出轻链和重链可变区基因 ,进行克隆并作核苷酸序列分析 ,发现 RT- PCR扩增出来的两条轻链和一条重链可变区基因分别为 4 0 0 bp左右 ,构建的 p MD18T- VL 和 p MD18T- VH 重组克隆载体 ,酶切与预期结果相符。测序得到它们的 DNA序列。结果表明 ,克隆的两条轻链可变区基因序列一致 ,长度均为 32 4 bp,属于鼠轻链 亚类。克隆的重链可变区基因长度为 375 bp,属于鼠重链 (C)亚类。 展开更多

关键词 T细胞分化抗原4 鼠抗体可变区基因 序列分析 基因克隆

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龋齿DNA疫苗(PGJAP)中污染大肠杆菌噬菌体的检测方法的建立 被引量：2

17

作者 赵亚杰 闭兰 +4 位作者 罗丹 王炯 齐建新 马荣华 张爱华 《微生物学免疫学进展》 2010年第2期36-39,共4页

龋齿DNA疫苗工程菌采用的大肠杆菌DH-5α在生产过程中极易污染大肠杆菌噬菌体,所以应对原始菌种、主菌种和工作菌种及大量生产时的发酵液作大肠杆菌噬菌体检测。用大肠杆菌噬菌体VCSM13为标准噬菌体株,对大肠杆菌C3000和DH-5α分别作噬... 龋齿DNA疫苗工程菌采用的大肠杆菌DH-5α在生产过程中极易污染大肠杆菌噬菌体,所以应对原始菌种、主菌种和工作菌种及大量生产时的发酵液作大肠杆菌噬菌体检测。用大肠杆菌噬菌体VCSM13为标准噬菌体株,对大肠杆菌C3000和DH-5α分别作噬菌斑检测和pfu值计算,验证并确定以VCSM13作为标准噬菌体株,C3000作为检测菌株,对龋齿DNA疫苗原始菌种、主菌种(第一代)、工作菌种(2007001)和其发酵液(200703)分别作噬菌体检测,并建立了检测大肠杆菌噬菌体的直接噬菌斑法。结果显示VCSM13在DH-5α的噬菌斑计数为76,pfu/ml为7.6×1013,C3000的噬菌斑计数为81,pfu/ml为8.1×1013,龋齿DNA疫苗的原始菌种、主菌种、工作菌种和发酵液,噬菌斑计数全部为0。Pfu也为0。阳性对照为74,pfu/ml是7.4×1013,阴性对照为0。通过对阳性对照样本作增殖法试验及挑斑接种验证后,证明此法操作简单,灵敏度高。 展开更多

关键词 DNA疫苗 大肠杆菌噬菌体 噬菌斑法

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HIV-1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定 被引量：1

18

作者 陈伟 闭兰 +2 位作者 朱华松 李茜 余模松 《微生物学免疫学进展》 2001年第4期1-5,共5页

用基因重组技术将截短的HIV 1p2 4基因和gp41基因连接成嵌合基因 ,插入质粒 pGEX 4T3,构建成重组表达质粒pGEX F。将 pGEX F转化大肠杆菌BL2 1。经IPTG诱导表达 ,pGEX F在大肠杆菌BL2 1中获得了高效表达。融合蛋白P2 4 gp41经Glutathion... 用基因重组技术将截短的HIV 1p2 4基因和gp41基因连接成嵌合基因 ,插入质粒 pGEX 4T3,构建成重组表达质粒pGEX F。将 pGEX F转化大肠杆菌BL2 1。经IPTG诱导表达 ,pGEX F在大肠杆菌BL2 1中获得了高效表达。融合蛋白P2 4 gp41经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化后 ,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清 ,P2 4 gp41只与HIV抗体阳性血清反应 ,证明获得的融合蛋白P2 4 gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性 。 展开更多

关键词 HIV-1 P24 GP41 融合蛋白 大肠杆菌 表达 纯化 截短体 免疫诊断试剂

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荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体 被引量：2

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作者 赵亚杰 闭兰 +5 位作者 孙可芳 端义坤 詹骞 金玉玲 吕兰君 张爱华 《微生物学免疫学进展》 2006年第2期32-34,共3页

以R-藻红蛋白(R-PE)标记小鼠抗人CD4单克隆抗体,形成单色或和用其他荧光染料标记的CD系列单抗组成双色、多色的荧光试剂,应用于流式细胞仪检测分析。用异双功能交联试剂SPDP和SMCC分别活化R-PE和CD4单抗,用DTT使经SPDP活化后的R-PE巯基... 以R-藻红蛋白(R-PE)标记小鼠抗人CD4单克隆抗体,形成单色或和用其他荧光染料标记的CD系列单抗组成双色、多色的荧光试剂,应用于流式细胞仪检测分析。用异双功能交联试剂SPDP和SMCC分别活化R-PE和CD4单抗,用DTT使经SPDP活化后的R-PE巯基化,再与用SMCC活化的CD4单抗交联。使用NEM终止交联反应,经Sephacryl S-300柱在AKTA FPLC快速液相色谱系统(简称AKTA)监测下分离纯化。结果用R-PE标记的抗CD4单抗,检测正常人外周血淋巴细胞表面CD4抗原的表达,经流式细胞仪(简称FACS)分析表明,R-PE标记的CD4抗体特异性保持完好,荧光强度较高,还可与用FITC标记的其它CD系列单抗配伍成双标或多标试剂。使用SPDP,SMCC异双功能交联试剂和DTT还原剂,成功地偶联了R-藻红蛋白和CD4单克隆抗体,可应用于流式细胞仪检测分析。 展开更多

关键词 R-藻红蛋白 小鼠抗人CD4单克隆抗体

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噬菌体展示抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子的筛选和序列分析

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作者 张爱华 端义坤 +5 位作者 闭兰 赵亚杰 张智 阎莹 王志友 余模松 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第1期1-4,共4页

目的　从自建的免疫噬菌体展示Fab抗体库中获得抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子 ,并进行基因序列分析。方法　采用纯化的乙型肝炎病毒表面抗原作为包被抗原 ,对自建的 4× 10 5Fab噬菌体抗体库进行富集筛选 ,从阳性强的次级库中... 目的　从自建的免疫噬菌体展示Fab抗体库中获得抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子 ,并进行基因序列分析。方法　采用纯化的乙型肝炎病毒表面抗原作为包被抗原 ,对自建的 4× 10 5Fab噬菌体抗体库进行富集筛选 ,从阳性强的次级库中挑选单个克隆菌 ,分别进行噬菌体ELISA、PCR和限制性内切酶鉴定后 ,再选取三者均为阳性的克隆菌进行基因序列分析。结果　共挑选了 6 0个单克隆菌株 ,其中噬菌体ELISA阳性有 2 7个 ,阳性率为 4 5 % ;PCR鉴定均为相应大小片段 ;限制性内切酶鉴定表明 2 7个阳性克隆菌中有 13个具有约 15 0 0bp的片段 ,其余均为约 75 0bp大小 ;BstOI酶切鉴定表明各克隆菌的酶切方式不同 ;选取 5个含约 15 0 0bp片段和 2个含约75 0bp片段的克隆菌株 ,经测序均为人免疫球蛋白基因 ,且重链分别属于VH3、VH4、VH5家族 ,轻链分别属于L5、L6、L8和 0 12 /0 2家族。结论　从自建的免疫噬菌体展示Fab抗体库中成功地获得了抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子。表明所构建的抗乙型肝炎病毒表面抗原的Fab抗体库的抗体基因具有多样性。 展开更多

关键词 FAB抗体 抗乙型肝炎病毒 表面抗原 阳性克隆 噬菌体展示 克隆 ELISA 限制性内切酶 包被 片段

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