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鼠伤寒沙门氏菌细菌铁蛋白(Bfr)的生物信息学分析及原核表达载体构建
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作者 张伟 史超 +6 位作者 于海涛 霍明凯 魏春燕 黄炜涵 周霞 王震 张辉 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第7期81-89,共9页
为了获得高纯度的鼠伤寒沙门氏菌细菌铁蛋白(Bfr),试验利用生物信息学软件对Bfr的结构、翻译后修饰和抗原表位等进行预测分析;通过PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌Bfr基因,将其与pET-32a(+)载体连接并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过SD... 为了获得高纯度的鼠伤寒沙门氏菌细菌铁蛋白(Bfr),试验利用生物信息学软件对Bfr的结构、翻译后修饰和抗原表位等进行预测分析;通过PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌Bfr基因,将其与pET-32a(+)载体连接并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过SDS-PAGE分析和Western-blot检测表达及纯化后的目的蛋白。结果表明:Bfr由476个氨基酸组成,分子式为C_(1440)H_(2406)N_(476)O_(606)S_(85),相对分子质量为38808.87,理论等电点为5.25;无信号肽和跨膜区,二级结构包含α-螺旋(81.01%)、无规则卷曲(13.19%)、β-折叠(3.16%)和延伸链(1.90%);含有9个线性B淋巴细胞抗原表位和5个T淋巴细胞抗原表位,以及10个磷酸化位点和10个互作蛋白,Bfr和Bfrd蛋白表面匹配良好、结合稳定。试验成功克隆出Bfr基因,其大小约为476 bp,获得大小约为35 ku的高纯度重组蛋白Bfr。说明Bfr蛋白具有良好的反应原性,有可能成为鼠伤寒沙门氏菌的疫苗开发和疾病诊断的候选蛋白。 展开更多
关键词 鼠伤寒沙门氏菌 细菌铁蛋白(Bfr) 生物信息学 原核表达 SDS-PAGE
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生鲜乳中海氏肠球菌的分离鉴定
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作者 史超 张伟 +6 位作者 刘素平 寇茜茜 刘荣慧 于海涛 霍明凯 王震 张辉 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第7期58-64,共7页
为了解生鲜乳中是否存在肠球菌污染,本试验从石河子某奶牛场无菌采集7份生鲜乳样品,通过细菌分离纯化、生化鉴定、16S rRNA和肠球菌RNA聚合酶α亚基(rpoA)编码基因的扩增和序列分析对分离菌株进行菌种鉴定,并利用纸片扩散法药敏试验和... 为了解生鲜乳中是否存在肠球菌污染,本试验从石河子某奶牛场无菌采集7份生鲜乳样品,通过细菌分离纯化、生化鉴定、16S rRNA和肠球菌RNA聚合酶α亚基(rpoA)编码基因的扩增和序列分析对分离菌株进行菌种鉴定,并利用纸片扩散法药敏试验和小鼠致病性试验确定分离菌株的药物敏感性和致病性。结果显示,从生鲜乳中分离到1株细菌,其培养特性和生化特性与肠球菌相似,16S rRNA基因测序结果显示其为肠球菌,rpoA基因测序结果显示其分子特征符合海氏肠球菌;药敏试验结果显示,分离海氏肠球菌对氨基糖苷类、林可胺类、磺胺类和多肽类药物表现一定的耐药性,而对四环素类、β-内酰胺类和部分喹诺酮类药物具有不同程度的敏感性;小鼠致病性试验结果显示,该菌株具有一定的致病性。本试验基于生鲜乳中海氏肠球菌的分离鉴定、耐药性和致病性分析,初步说明该牛场乳品中存在肠球菌污染的风险,且分离菌株具有一定耐药性和致病性,因此需在日常生产加工环节加强监测。 展开更多
关键词 生鲜乳 海氏肠球菌 rpoA基因 耐药性 致病性
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DDX1影响猪流行性腹泻病毒复制的机制研究
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作者 霍明凯 关飞虎 +4 位作者 邱润辉 魏春燕 于海涛 朱嘉乐 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1556-1566,共11页
【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:X... 【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:XM_021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX 1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋白的表达水平;使用生物信息学软件预测DDX1蛋白的磷酸化位点;免疫沉淀试验检测PEDV感染IPI-2I细胞12 h后DDX1的磷酸化水平。【结果】PCR成功扩增得到大小为2223 bp的DDX 1目的基因条带。双酶切鉴定结果显示,成功构建pMD19-T-DDX1克隆载体和pcDNA3.1-DDX1真核表达载体。与PBS组相比,转染pcDNA3.1-DDX1的细胞DDX1蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),表明DDX1转染成功。间接免疫荧光试验结果显示,与PBS组相比,PEDV感染组中出现大量绿色荧光信号,表明PEDV感染IPI-2I细胞模型构建成功;与PBS组相比,PEDV N蛋白的荧光信号明显减少,PEDV N基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析发现,DDX1蛋白具有多个磷酸化位点,其中包括17个丝氨酸、12个苏氨酸及6个酪氨酸。免疫沉淀试验结果显示,与未感染组相比,PEDV感染组中DDX1磷酸化水平极显著上升(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pcDNA3.1-DDX1真核表达载体,发现PEDV感染IPI-2I细胞12 h后,DDX1抑制了PEDV的复制,升高了磷酸化水平,说明DDX1在PEDV感染期间可能通过磷酸化抑制PEDV的复制。 展开更多
关键词 DDX1 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 磷酸化
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石河子地区奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验 被引量:3
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作者 刘荣慧 寇茜茜 +5 位作者 张伟 史超 于海涛 霍明凯 王震 张辉 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第12期92-96,146,147,共7页
为了解新疆石河子地区奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌的耐药情况,试验采用选择培养基对来自石河子地区规模化奶牛场患临床型乳腺炎奶牛乳样中的葡萄球菌进行分离,并对分离菌进行革兰氏染色观察、生化鉴定、16S rDNA基因PCR鉴定和药敏试验... 为了解新疆石河子地区奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌的耐药情况,试验采用选择培养基对来自石河子地区规模化奶牛场患临床型乳腺炎奶牛乳样中的葡萄球菌进行分离,并对分离菌进行革兰氏染色观察、生化鉴定、16S rDNA基因PCR鉴定和药敏试验。结果表明:革兰氏染色观察到两种形态的葡萄球菌疑似菌,经生化鉴定及16S rDNA基因PCR鉴定确定分离到1株金黄色葡萄球菌和1株产色葡萄球菌,分别命名为金黄色葡萄球菌sau raw milk China和产色葡萄球菌sch raw milk China;其中金黄色葡萄球菌sau raw milk China对氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素和复方新诺明耐药,对青霉素G、环丙沙星、氟哌酸中介,对头孢噻吩、红霉素、克林霉素、四环素和氧氟沙星敏感;而产色葡萄球菌sch raw milk China对红霉素中介,对其他11种药物敏感。说明金黄色葡萄球菌和产色葡萄球菌可能是石河子地区奶牛临床型乳腺炎的主要病原菌,且对临床常用抗生素具有一定的敏感性。 展开更多
关键词 石河子地区 奶牛 临床型乳腺炎 葡萄球菌 分离鉴定 药敏试验
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多黏菌素耐药mcr基因的研究进展 被引量:1
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作者 曹兴旺 李益涛 +8 位作者 徐道元 付祥益宁 何欣 陈扬 田美卉 王超丽 霍明凯 肖陈城 李亚玲 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第19期29-36,共8页
多黏菌素是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,然而质粒介导的多黏菌素抗性基因mcr-1及其变异体在全球传播,给畜牧业健康发展和人类公共卫生安全带来了严重挑战。文章综述了mcr-1基因的发现、结构和流行情况,mcr-1基因变... 多黏菌素是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,然而质粒介导的多黏菌素抗性基因mcr-1及其变异体在全球传播,给畜牧业健康发展和人类公共卫生安全带来了严重挑战。文章综述了mcr-1基因的发现、结构和流行情况,mcr-1基因变异体、流行特征以及防治策略等的研究进展,以期为相关科研人员和临床工作者提供参考,共同应对抗生素耐药日益严峻的局面。 展开更多
关键词 mcr-1基因 多黏菌素 耐药性 肠杆菌科 质粒
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校园论语
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作者 李建华 孟强 +15 位作者 吴峰 唐登红 白磊 刘俊伟 霍明凯 刘吉 王琦 李觉 田韧 雷洪强 周庆华 杨明 朱小平 仲利强 赵雪亮 李茜 《规划师》 2003年第1期56-56,共1页
本期“校园论语”栏目由西安建筑科技大学建筑学院硕士研究生会与《规划师》杂志社共同主办,结合学院部分硕士学位论文研究课题,针对西部大开发、生态城市建设、城市文脉延续等热点问题展开讨论。此次论语诚邀规划专家参与,青年学子在... 本期“校园论语”栏目由西安建筑科技大学建筑学院硕士研究生会与《规划师》杂志社共同主办,结合学院部分硕士学位论文研究课题,针对西部大开发、生态城市建设、城市文脉延续等热点问题展开讨论。此次论语诚邀规划专家参与,青年学子在导师的指导下关注规划学科的前沿问题和学科动态,充分体现了“以人为本、尊重自然、注重人文、承启历史、回应时代、面向未来”的学术思维。同时,本期还发表了西安建筑科技大学建筑学院研究生近年来参加国际设计竞赛的部分作品和感想,展示了学子们丰富多彩的课余生活和创新能力。 展开更多
关键词 生态导向 总体布局 城市规划 生态环境 城市建设
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布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究 被引量:4
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作者 邱润辉 关飞虎 +7 位作者 王梓行 郭嘉 朱德馨 张伟 魏春燕 霍明凯 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1630-1640,共11页
【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合... 【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1800 V电压、400Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】试验成功获得片段大小为522、539、1054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BMCO基因缺失株 生长曲线 胞内生存
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高层建筑的近地空间与城市空间的整合
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作者 霍明凯 《规划师》 2003年第1期58-58,共1页
关键词 高层建筑 近地空间 城市空间
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