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转基因水稻中GUS蛋白质的检测及其表达特征 被引量：10
1
作者 牛东东 郝育杰 +13 位作者 荣瑞娟 韦汉福 兰金苹 史佳楠 魏健 李雪姣 杨烁 奚文辉 武鹏程 刘丽娟 吴琳 刘斯奇 尹长城 刘国振 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第14期2715-2722,共8页
【目的】建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法,并了解花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以细菌基因组DNA为模板,PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体pET30a中,测序验证的重组子转入... 【目的】建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法,并了解花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以细菌基因组DNA为模板,PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体pET30a中,测序验证的重组子转入大肠杆菌表达菌BL21中,IPTG诱导获得重组表达的GUS蛋白质,用HIS-tag beads纯化后作为免疫原免疫小鼠制备GUS蛋白质特异的抗体,通过免疫印迹分析筛选高特异性的单克隆抗体,用Broadford法对重组的GUS蛋白质进行定量,对不同浓度的GUS蛋白质进行免疫印迹分析,绘制检测GUS蛋白质的标准曲线,通过与标准曲线的比较对水稻叶片中GUS蛋白质进行定量分析。提取不同时期、不同部位的水稻总蛋白质,包括苗期的地上部、地下部,分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶枕、叶片上部、叶片中部和叶片下部,孕穗期的茎、穗轴、叶鞘、叶枕、叶片、幼穗(长度分别为1、2、10和20 cm),开花期的茎、穗轴、叶鞘、叶片、穗子,成熟期的茎、叶片、授粉后不同时期的种子(分别为授粉后10、20、30和40 d)、乳熟期的胚、胚乳和颖壳、成熟种子的全种子、胚、胚乳和颖壳以及不同时期的叶片和根部材料等。SDS-PAGE分离后用抗体检测其GUS蛋白质的丰度。【结果】筛选获得了高特异性的抗GUS单克隆抗体(编号为#27),用该抗体检测转基因水稻中及重组的GUS蛋白质均呈现特异条带,没有可见的背景信号,用本研究建立的免疫印迹方法对重组GUS蛋白质的检测下限约为4 ng,可检出转基因水稻单粒大米2.5%样品中(约0.6 mg)的GUS蛋白质。在不同时期的转基因水稻叶片中GUS蛋白质的表达丰度基本稳定,而在水稻根部的GUS丰度随生长急剧减少,5叶期根中的表达量不到3叶期的三分之一,到6叶期检测不到GUS蛋白质。在水稻苗期叶片中,GUS蛋白质约占鲜重的0.02‰。另外,除分蘖期以后的根部之外,GUS蛋白质几乎在所有的水稻组织部位中呈组成型表达,只是不同组织中的表达量略有差异,如在孕穗期和开花期的茎及颖壳中的表达量较低。【结论】建立了具有应用价值的对转基因水稻中GUS蛋白质丰度检测的免疫印记方法。该方法特异性高、样品用量少、不依赖于GUS蛋白质的酶活性、测定结果易于在不同实验室间比较。证明了35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中基本呈组成型表达。 展开更多
关键词 水稻 转基因植物 CaMV 35S启动子 GUS蛋白质 免疫印迹
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NPTⅡ蛋白质在转基因水稻中的表达特征研究 被引量：5
2
作者 兰金苹 武鹏程 +11 位作者 郭美岑 史佳楠 韦汉福 荣瑞娟 郝育杰 杨烁 白影影 李莉云 吴琳 刘斯奇 尹长城 刘国振 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2015年第3期268-276,共9页
nptⅡ编码新霉素磷酸转移酶,是转基因实验中最常用的筛选标记基因之一.本研究中,表达了重组新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)蛋白质,制备了单克隆抗体,建立了用免疫印迹检测转基因水稻中NPTⅡ蛋白质的方法,调查了NPTⅡ蛋白质的表达特征,包括遗... nptⅡ编码新霉素磷酸转移酶,是转基因实验中最常用的筛选标记基因之一.本研究中,表达了重组新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)蛋白质,制备了单克隆抗体,建立了用免疫印迹检测转基因水稻中NPTⅡ蛋白质的方法,调查了NPTⅡ蛋白质的表达特征,包括遗传特征、表达时空特征、表达丰度和亚细胞定位等.结果表明,该方法可检测到单粒稻米的0.25%(约0.025 mg)样品中的NPTⅡ蛋白质,NPTⅡ的表达符合显性遗传规律,根据NPTⅡ的表达可对转基因T1代种子进行阴阳性及纯合株系的鉴定,对T1幼苗中NPTⅡ丰度的分析可为纯合单株的鉴定提供参考信息.定量分析表明苗期叶片中NPTⅡ蛋白质的含量约为鲜重的0.08‰.在Ca MV-35S启动子驱动下NPTⅡ蛋白质在水稻苗期、成株期的叶片和根部组织中表达量较高,而在分蘖期、孕穗期较低,NPTⅡ在不同时期的根、茎、叶、穗子、花及种子等组织中均有表达,只是在分蘖节、茎节、穗轴和花药等组织中表达量相对较低.此外,NPTⅡ蛋白质的表达主要定位在细胞质中.综上所述,本研究建立了具有应用价值的检测NPTⅡ蛋白质的免疫印记方法并系统揭示了其在水稻中的表达特征. 展开更多
关键词 转基因水稻 CaMV-35S启动子 NPTⅡ蛋白质 免疫印迹技术
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Label-Free and Real-Time Monitor of Binding and Dissociation Processes between Protein A and Swine IgG by Oblique-Incidence Reflectivity Difference Method
3
作者 何立平 刘爽 +6 位作者 戴俊 吴琳 刘国振 韦汉福 吕惠宾 金奎娟 杨国桢 《Chinese Physics Letters》 SCIE CAS CSCD 2015年第2期35-38,共4页
生命科学为没有标签、即时的察觉方法有需要。在这份报纸，我们选择了 staphylococcal 蛋白质 A (矿泉)和猪免疫球蛋白 G ( IgG )，并且与不同集中监视在矿泉和猪 IgG 之间的绑定，象在不同 pH 复杂的矿泉猪 IgG 的分离一样，磷酸盐的... 生命科学为没有标签、即时的察觉方法有需要。在这份报纸，我们选择了 staphylococcal 蛋白质 A (矿泉)和猪免疫球蛋白 G ( IgG )，并且与不同集中监视在矿泉和猪 IgG 之间的绑定，象在不同 pH 复杂的矿泉猪 IgG 的分离一样，磷酸盐的价值以一种没有标签、即时的方式由倾斜发生的反射率差别( OIRD )缓冲。我们获得断断续续地反应相应于矿泉和猪 IgG 的绑定和分离的动态曲线。通过我们试验性的结果的分析，我们能获得抑制系数和磷酸盐缓冲区的不同 pH 价值的矿泉和猪 IgG 的分离时间。结果证明 OIRD 技术是为监视 biomolecule 相互作用的动态过程并且完成反应动力学的量的信息的一个竞争方法。 展开更多
关键词 葡萄球菌蛋白A 实时监控 倾斜入射 IGG 无标记 反射率 绑定 离解
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转基因水稻中HPT蛋白质的检测及表达特征研究 被引量：5
4
作者 杨烁 郝育杰 +7 位作者 兰金苹 韦汉福 魏健 荣瑞娟 武鹏程 刘国振 尹长城 李莉云 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期61-67,共7页
hpt是转基因植物中最常用的筛选标记基因之一,建立了HPT蛋白质免疫印迹检测技术、了解其在转基因植物中的表达特征具有重要的理论意义和应用价值。在大肠杆菌中进行了HPT蛋白质的重组表达,利用纯化的HPT蛋白质制备了其特异性的单克隆抗... hpt是转基因植物中最常用的筛选标记基因之一,建立了HPT蛋白质免疫印迹检测技术、了解其在转基因植物中的表达特征具有重要的理论意义和应用价值。在大肠杆菌中进行了HPT蛋白质的重组表达,利用纯化的HPT蛋白质制备了其特异性的单克隆抗体,采用免疫印迹学方法对转基因水稻4021中HPT蛋白质的表达情况进行了检测,该方法可检测出单粒稻米的10%(约1.5mg)所含的HPT蛋白质。定量分析发现水稻苗期HPT蛋白质含量约占鲜重的0.01‰。对Ca MV35S启动子驱动下的转基因水稻中HPT蛋白质的表达谱进行分析,发现其在苗期和成株期的叶片中表达量较高,在灌浆期的种子中呈现不断增加的趋势,而在茎、分蘖节、茎节、叶鞘、叶枕和根等组织中表达量较低。建立了完整的利用免疫印迹方法检测HPT蛋白质的技术,同时系统分析了HPT蛋白质在转基因水稻中的表达谱。 展开更多
关键词 转基因水稻 HPT蛋白质 免疫印迹技术 筛选标记基因
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基于抗体的水稻蛋白质组学理论与实践
5
作者 刘国振 李莉云 +58 位作者 窦世娟 杨明 李晓明 张剑硕 侯明明 曹英豪 刘丽娟 魏健 郭亚璐 史佳楠 陈悦 王田幸子 范伟 张柳 马金姣 张彤 刘玉晴 燕高伟 徐珊 杨烁 周艳 杜铁民 牛东东 荣瑞娟 黄腾 柴帅杰 郭美岑 缪刘杨 李雪姣 徐文静 关明俐 贾霖 贾盟 曾祥然 高庆华 刘钊 王宪云 刘雨萌 兰金苹 白辉 刘斯奇 尹长城 吴琳 韦汉福 韩宇宁 赵丽英 杨春霞 武鹏程 马晓飞 赵志静 潘秦 郝育杰 陈浩 赵磊 康昊翔 耿广荟 孔令男 史晓儒 奚文辉 《中国科技成果》 2022年第24期10-11,共2页
水稻是最重要的粮食作物之一,不仅是世界上一半以上的人口以水稻作为主粮,也是基础研究的模式植物。项目团队在前人研究的基础上,结合蛋白质研究的需求和发展趋势,凝练提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念,十多年来,不断优化技术路... 水稻是最重要的粮食作物之一,不仅是世界上一半以上的人口以水稻作为主粮,也是基础研究的模式植物。项目团队在前人研究的基础上,结合蛋白质研究的需求和发展趋势,凝练提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念,十多年来,不断优化技术路线,积极拓展和丰富相关理论并开展实践。1主要创新点1.1首次提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念。 展开更多
关键词 蛋白质组学 结合蛋白质 理论与实践 项目团队 主要创新点 开展实践 发展趋势 抗体
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