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中东呼吸综合征冠状病毒量子点免疫层析试纸的制备 被引量：3
1
作者 黄培 韩秋雪 +9 位作者 胡星星 金宏丽 曹增国 迟航 赵永坤 冯娜 高玉伟 王化磊 杨松涛 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第6期557-561,共5页
目的制备一种能快速检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的量子点免疫层析试纸,以期用于MERSCoV感染检测。方法采用EDC偶联法将羧基化CdTe/ZnSe量子点与抗MERS-CoV RBD的单克隆抗体(mAb/MERS-CoV)共价偶联,通过斑点免疫印迹检验偶联... 目的制备一种能快速检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的量子点免疫层析试纸,以期用于MERSCoV感染检测。方法采用EDC偶联法将羧基化CdTe/ZnSe量子点与抗MERS-CoV RBD的单克隆抗体(mAb/MERS-CoV)共价偶联,通过斑点免疫印迹检验偶联物的活性。以CdTe/ZnSe量子点标记的mAb/MERS-CoV作为荧光标记物,采用免疫层析技术制备量子点免疫层析试纸,用于MERS-CoV检测。并对该方法进行特异性、敏感性评价。结果 CdTe/ZnSe量子点可偶联mAb/MERS-CoV,且偶联物具有良好的生物活性。以其作为荧光标记物建立的量子点免疫层析试纸可特异性检测MERS-CoV假病毒,最低检测限为2×53 TCID50/ml,其他对照病毒检测均阴性。结论制备的MERS-CoV量子点免疫层析试纸具有简便、快速、特异等优点,可用于MERS-CoV感染快速诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 中东呼吸综合征冠状病毒 量子点 免疫层析试纸
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埃博拉病毒抗体间接血凝检测方法的建立
2
作者 张颖 曹增国 +13 位作者 吴芳芳 李国华 李恩涛 焦翠翠 迟航 金宏丽 韩秋雪 张胜男 王化磊 冯娜 高玉伟 赵永坤 杨松涛 夏咸柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期688-694,共7页
以纯化后的埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)糖蛋白(GP)作为抗原,致敏醛化的绵羊红细胞,进行最佳反应条件优化,建立间接血凝抗体检测方法。以EBOV高免马血清、纯化的IgG和精制免疫球蛋白F(ab’)_2为待检样品进行检测,并将检测结果与假病毒... 以纯化后的埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)糖蛋白(GP)作为抗原,致敏醛化的绵羊红细胞,进行最佳反应条件优化,建立间接血凝抗体检测方法。以EBOV高免马血清、纯化的IgG和精制免疫球蛋白F(ab’)_2为待检样品进行检测,并将检测结果与假病毒中和试验检测结果相比较。结果显示,该方法可特异性检测EBOV抗体,与马尔堡病毒、裂谷热病毒等的阳性血清均不发生反应;与假病毒中和试验测得的抗体效价增长规律相一致。结果表明,本试验成功建立了EBOV抗体间接血凝检测方法,该方法安全、简便、快捷,为EBOV疫苗免疫后的效果评价提供了又一新的检测方法。 展开更多
关键词 埃博拉病毒 糖蛋白(GP) 间接血凝试验 抗体检测
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裂谷热病毒eGn蛋白的制备及免疫原性验证
3
作者 韩秋雪 黄培 +11 位作者 毕津豪 金宏丽 赵永坤 焦翠翠 张胜男 徐胜男 张颖 曹增国 迟航 王化磊 杨松涛 夏咸柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1506-1512,共7页
通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrapTMFF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c... 通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrapTMFF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。 展开更多
关键词 裂谷热病毒 Gn胞外区(eGn) 单克隆抗体
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SARS-CoV-2核糖体展示纳米抗体文库的构建与筛选 被引量：2
4
作者 王馨悦 韩秋雪 +9 位作者 王振山 焦翠翠 毕津豪 许梦园 赵永坤 冯娜 王铁成 迟航 杨松涛 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第3期249-253,共5页
目的 通过核糖体展示技术构建一个库容量大、多样性好的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)特异性纳米抗体文库;利用真核表达系统表达并制备具有筛选质量的SARS-CoV-2受体结合域... 目的 通过核糖体展示技术构建一个库容量大、多样性好的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)特异性纳米抗体文库;利用真核表达系统表达并制备具有筛选质量的SARS-CoV-2受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)蛋白,并作为钓饵蛋白应用于纳米抗体的筛选。方法 利用多种SARS-CoV-2特异性免疫原免疫羊驼,分离高免羊驼外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),提取总RNA并反转录获得cDNA,通过巢式PCR扩增纳米抗体基因,同时引入核糖体文库所需要的展示元件。利用重叠延伸PCR将VHH片段与间隔序列gene-Ⅲ连接,构建核糖体展示纳米抗体文库。利用Expi293F哺乳动物细胞表达SARS-CoV-2 RBD蛋白,通过StrepTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,将其作为钓饵蛋白对所构建的纳米抗体文库进行四轮特异性筛选。结果 成功构建核糖体展示纳米抗体文库,该文库的多样性高、完整性好,有效库容为1.12×10^(13)。利用哺乳动物细胞表达系统表达出SARS-CoV-2 RBD蛋白,纯度高达97.5%。通过对核糖体纳米抗体文库进行四轮特异性筛选,获得纳米抗体的基因序列,经鉴定序列多样性丰富。结论 成功构建SARS-CoV-2核糖体展示纳米抗体文库,制备出具有筛选质量的抗原并应用于抗体库的筛选,获得结构完整且序列多样性丰富的纳米抗体基因序列,为SARS-CoV-2纳米抗体的获得奠定了研究基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 纳米抗体 核糖体展示 抗体库 真核表达
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马抗SARS-CoV-2特异性IgG与F(ab’)2的制备研究 被引量：1
5
作者 许梦园 毕津豪 +9 位作者 王馨悦 张颖 韩秋雪 莫若 闫飞虎 杨松涛 冯娜 王铁成 赵永坤 夏咸柱 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期846-852,共7页
收集经SARS-CoV-2病毒样颗粒(VLPs)为免疫原免疫的健康马血清,采用亲和层析法分离血清中总IgG,利用胃蛋白酶消化Fc片段获得免疫球蛋白F(ab’)_(2),将二者使用结合RBD蛋白的免疫层析柱进行纯化,获得具有高度特异性的马抗SARS-CoV-2 IgG... 收集经SARS-CoV-2病毒样颗粒(VLPs)为免疫原免疫的健康马血清,采用亲和层析法分离血清中总IgG,利用胃蛋白酶消化Fc片段获得免疫球蛋白F(ab’)_(2),将二者使用结合RBD蛋白的免疫层析柱进行纯化,获得具有高度特异性的马抗SARS-CoV-2 IgG与免疫球蛋白F(ab’)_(2)。结果显示,特异性IgG与F(ab’)_(2)浓度是2.36 mg/mL和1.05 mg/mL,收率为11%和4.89%,纯度在91%与96%以上,对假病毒的半抑制浓度(IC50)为1.406μg/mL和0.862μg/mL。结果表明,成功制备了纯度高、特异性强且具有中和活性的马抗SARS-CoV-2特异性IgG与特异性F(ab’)_(2),为制备安全高效的抗SARS-CoV-2治疗性抗体药物奠定了基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 马免疫球蛋白 F(ab’)2 亲和层析 假病毒中和试验
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骆驼科动物中东呼吸综合征冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
6
作者 王振山 韩秋雪 +9 位作者 王馨悦 毕津豪 李恩涛 莫若 赵永坤 冯娜 王铁成 杨松涛 迟航 夏咸柱 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1230-1237,共8页
通过PCR扩增中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)RBD基因片段,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,转染哺乳动物细胞Expi293F,并利用带有StrepTrap标签的亲和柱纯化制备MERS-CoV RBD蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化后的RBD蛋白。以... 通过PCR扩增中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)RBD基因片段,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,转染哺乳动物细胞Expi293F,并利用带有StrepTrap标签的亲和柱纯化制备MERS-CoV RBD蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化后的RBD蛋白。以RBD蛋白为包被抗原,建立骆驼科动物MERS-CoV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,MERS-CoV RBD蛋白在Expi293F细胞中以分泌形式表达,纯化后RBD蛋白纯度大于95%;成功建立了骆驼科动物MERS-CoV抗体间接ELISA检测方法。将其初步应用于骆驼、羊驼血清抗体的检测,检测结果与已知血清结果相符合。基于真核表达纯化的高纯度MERSCoV RBD蛋白,建立了骆驼科动物MERS-CoV抗体间接ELISA检测方法,为骆驼、羊驼等骆驼科动物的MERSCoV疫苗免疫效果评价、疫病监测等相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 中东呼吸综合征冠状病毒 真核表达 RBD蛋白 间接ELISA检测
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