目的:基于“柔肝养筋”理论探讨小鼠肝脏来源外泌体对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型小鼠膝关节软骨的影响。方法:以超速离心法从3月龄(年轻)和22月龄(老年)C57BL/6雄性小鼠肝脏提取外泌体。将48只7周龄SPF级C57BL/6J雄性小...目的:基于“柔肝养筋”理论探讨小鼠肝脏来源外泌体对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型小鼠膝关节软骨的影响。方法:以超速离心法从3月龄(年轻)和22月龄(老年)C57BL/6雄性小鼠肝脏提取外泌体。将48只7周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组,每组12只。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组小鼠采用前交叉韧带横断术进行KOA造模,Sham组小鼠接受手术但不离断前交叉韧带。术后14 d开始,向Young-EVs组和Aged-EVs组小鼠膝关节腔分别注射10μL年轻和老年小鼠肝脏来源外泌体,每周2次,连续注射4周;Sham组和KOA组用同样方法向膝关节腔注射10μL PBS溶液。外泌体干预结束后,对各组小鼠造模侧膝关节进行X线检查;苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色后进行组织病理学观察,并采用国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)骨关节炎软骨组织病理学评价系统及Mankin病理评分系统评价小鼠软骨退变程度;免疫组化法检测软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ,COLⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)13和一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)5表达量。结果:①小鼠膝关节X线检查结果。Sham组小鼠膝关节关节间隙正常,关节面平整光滑,软骨完整,关节边缘无骨赘形成,Kellgren-Lawrence分级为0级;KOA组小鼠膝关节间隙未见明显狭窄,关节面粗糙,软骨出现部分缺损,关节边缘可见明显骨赘形成,Kellgren-Lawrence分级为Ⅱ级;Young-EVs组小鼠膝关节间隙轻微变窄,关节表面稍有粗糙表现,软骨缺损较KOA组减少,关节边缘可见轻微骨赘形成,Kellgren-Lawrence分级为Ⅰ级;Aged-EVs组小鼠膝关节间隙、关节表面粗糙程度、软骨缺损情况、关节内游离体数量较KOA组更为严重,Kellgren-Lawrence分级为Ⅲ级。②小鼠膝关节软骨组织病理学观察结果。4组小鼠膝关节软骨OARSI评分和Mankin评分组间总体比较,差异均有统计学意义[OARSI评分:(0.417±0.376)分,(4.500±0.632)分,(2.417±0.492)分,(5.417±0.492)分,F=116.800,P=0.000;Mankin评分:(1.083±0.665)分,(7.250±0.880)分,(3.583±0.917)分,(8.833±0.683)分,F=117.100,P=0.000]。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组的OARSI评分和Mankin评分均高于Sham组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);Young-EVs组的OARSI评分和Mankin评分均低于KOA组(P=0.000,P=0.000);Aged-EVs组的OARSI评分和Mankin评分均高于KOA组、Young-EVs组(P=0.025,P=0.000;P=0.015,P=0.000)。③小鼠膝关节软骨组织免疫组织化学检测结果。4组小鼠膝关节软骨中COLⅡ和ACAN阳性表达面积比组间总体比较,差异均有统计学意义[COLⅡ:(40.050±2.324)%,(26.083±1.119)%,(23.317±2.599)%,(16.717±2.479)%,F=118.500,P=0.000;ACAN:(51.500±3.191)%,(17.700±3.415)%,(19.383±3.924)%,(12.300±1.908)%,F=185.500,P=0.000]。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组的COLⅡ和ACAN阳性表达面积比均低于Sham组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);Young-EVs组与KOA组COLⅡ、ACAN阳性表达面积比的组间差异均无统计学意义(P=0.167,P=0.799);Aged-EVs组的COLⅡ和ACAN阳性表达面积比均低于KOA组、Young-EVs组(P=0.000,P=0.000;P=0.039,P=0.005)。4组MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比组间总体比较,差异均有统计学意义[MMP13:(11.733±2.191)%,(46.150±6.237)%,(34.417±5.027)%,(57.233±4.049)%,F=106.600,P=0.000;ADAMTS5:(7.950±1.344)%,(30.533±6.184)%,(22.083±3.418)%,(39.317±5.606)%,F=51.450,P=0.000]。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组的MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比均高于Sham组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);Young-EVs组的MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比均低于KOA组(P=0.002,P=0.021);Aged-EVs组的MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比均高于KOA组、Young-EVs组(P=0.003,P=0.000;P=0.016,P=0.000)。结论:小鼠肝脏来源外泌体可能参与软骨细胞合成及分解代谢反应;其中老年小鼠肝脏来源外泌体可加速细胞外基质降解、减少聚集蛋白聚糖合成,加剧KOA小鼠软骨退变;而年轻小鼠肝脏来源外泌体可抑制软骨细胞外基质降解,保护KOA小鼠软骨。展开更多
文摘目的:基于“柔肝养筋”理论探讨小鼠肝脏来源外泌体对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型小鼠膝关节软骨的影响。方法:以超速离心法从3月龄(年轻)和22月龄(老年)C57BL/6雄性小鼠肝脏提取外泌体。将48只7周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组,每组12只。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组小鼠采用前交叉韧带横断术进行KOA造模,Sham组小鼠接受手术但不离断前交叉韧带。术后14 d开始,向Young-EVs组和Aged-EVs组小鼠膝关节腔分别注射10μL年轻和老年小鼠肝脏来源外泌体,每周2次,连续注射4周;Sham组和KOA组用同样方法向膝关节腔注射10μL PBS溶液。外泌体干预结束后,对各组小鼠造模侧膝关节进行X线检查;苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色后进行组织病理学观察,并采用国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)骨关节炎软骨组织病理学评价系统及Mankin病理评分系统评价小鼠软骨退变程度;免疫组化法检测软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ,COLⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)13和一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)5表达量。结果:①小鼠膝关节X线检查结果。Sham组小鼠膝关节关节间隙正常,关节面平整光滑,软骨完整,关节边缘无骨赘形成,Kellgren-Lawrence分级为0级;KOA组小鼠膝关节间隙未见明显狭窄,关节面粗糙,软骨出现部分缺损,关节边缘可见明显骨赘形成,Kellgren-Lawrence分级为Ⅱ级;Young-EVs组小鼠膝关节间隙轻微变窄,关节表面稍有粗糙表现,软骨缺损较KOA组减少,关节边缘可见轻微骨赘形成,Kellgren-Lawrence分级为Ⅰ级;Aged-EVs组小鼠膝关节间隙、关节表面粗糙程度、软骨缺损情况、关节内游离体数量较KOA组更为严重,Kellgren-Lawrence分级为Ⅲ级。②小鼠膝关节软骨组织病理学观察结果。4组小鼠膝关节软骨OARSI评分和Mankin评分组间总体比较,差异均有统计学意义[OARSI评分:(0.417±0.376)分,(4.500±0.632)分,(2.417±0.492)分,(5.417±0.492)分,F=116.800,P=0.000;Mankin评分:(1.083±0.665)分,(7.250±0.880)分,(3.583±0.917)分,(8.833±0.683)分,F=117.100,P=0.000]。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组的OARSI评分和Mankin评分均高于Sham组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);Young-EVs组的OARSI评分和Mankin评分均低于KOA组(P=0.000,P=0.000);Aged-EVs组的OARSI评分和Mankin评分均高于KOA组、Young-EVs组(P=0.025,P=0.000;P=0.015,P=0.000)。③小鼠膝关节软骨组织免疫组织化学检测结果。4组小鼠膝关节软骨中COLⅡ和ACAN阳性表达面积比组间总体比较,差异均有统计学意义[COLⅡ:(40.050±2.324)%,(26.083±1.119)%,(23.317±2.599)%,(16.717±2.479)%,F=118.500,P=0.000;ACAN:(51.500±3.191)%,(17.700±3.415)%,(19.383±3.924)%,(12.300±1.908)%,F=185.500,P=0.000]。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组的COLⅡ和ACAN阳性表达面积比均低于Sham组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);Young-EVs组与KOA组COLⅡ、ACAN阳性表达面积比的组间差异均无统计学意义(P=0.167,P=0.799);Aged-EVs组的COLⅡ和ACAN阳性表达面积比均低于KOA组、Young-EVs组(P=0.000,P=0.000;P=0.039,P=0.005)。4组MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比组间总体比较,差异均有统计学意义[MMP13:(11.733±2.191)%,(46.150±6.237)%,(34.417±5.027)%,(57.233±4.049)%,F=106.600,P=0.000;ADAMTS5:(7.950±1.344)%,(30.533±6.184)%,(22.083±3.418)%,(39.317±5.606)%,F=51.450,P=0.000]。KOA组、Young-EVs组及Aged-EVs组的MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比均高于Sham组(P=0.000,P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000);Young-EVs组的MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比均低于KOA组(P=0.002,P=0.021);Aged-EVs组的MMP13和ADAMTS5阳性表达面积比均高于KOA组、Young-EVs组(P=0.003,P=0.000;P=0.016,P=0.000)。结论:小鼠肝脏来源外泌体可能参与软骨细胞合成及分解代谢反应;其中老年小鼠肝脏来源外泌体可加速细胞外基质降解、减少聚集蛋白聚糖合成,加剧KOA小鼠软骨退变;而年轻小鼠肝脏来源外泌体可抑制软骨细胞外基质降解,保护KOA小鼠软骨。
