猪繁殖与呼吸综合征病毒谱系8毒株特异性单克隆抗体研制

1

作者 任语馨 张杰 +4 位作者 高雁怩 孙杨杨 张路捷 白娟 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2025年第1期111-118,共8页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株存在多种基因亚型(谱系)和抗原性差异,为了鉴别不同谱系流行毒株,选取PRRSV谱系8毒株BB0907(高致病性毒株)非结构蛋白2(NSP2)高变区基因片段(tNSP2),采用大肠杆菌表达制备获得NSP2重组蛋白,并免疫... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株存在多种基因亚型(谱系)和抗原性差异,为了鉴别不同谱系流行毒株,选取PRRSV谱系8毒株BB0907(高致病性毒株)非结构蛋白2(NSP2)高变区基因片段(tNSP2),采用大肠杆菌表达制备获得NSP2重组蛋白,并免疫BALB/c小鼠。结果:研制出5株NSP2单克隆抗体(3D6、6B2、6C3、8C2和8H6),小鼠腹水ELISA抗体效价均达1∶216000;5株单抗轻链类型都为Kappa型,3D6、6B2和6C8的重链类型为IgG1,8C2的重链类型为IgG2b,8H6重链类型为IgG2a;通过构建tNSP2蛋白截短体,Western blot鉴定出4个抗原表位,即^(485)GPLNFPTPSE^(494)、^(555)FPLAPSQNMG564、575EVLSEISDIL^(584)和^(585)NDTPAPVS^(593);间接免疫荧光试验结果显示,这些单抗均能与PRRSV谱系8毒株发生特异性反应,但与谱系1和谱系5毒株不反应。本研究为PRRSV分离毒株抗原鉴别诊断和生物学研究提供了有意义的研究材料。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP2 单克隆抗体 B细胞表位

下载PDF 职称材料

猪IL-1β单克隆抗体制备及其抗炎症反应活性

2

作者 李璠 孙海凤 +5 位作者 孙萌 高雁怩 孙杨杨 张路捷 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期890-899,共10页

IL-1β可介导炎症病理,阻断IL-1活性具有重要抗炎治疗作用。本研究通过构建猪IL-1β原核表达质粒,进行大肠杆菌表达和蛋白纯化,制备重组蛋白。采用细胞杂交瘤技术制备获得4株稳定分泌IL-1β单克隆抗体杂交瘤细胞株(1E2、2H3、5H3及7E7);... IL-1β可介导炎症病理,阻断IL-1活性具有重要抗炎治疗作用。本研究通过构建猪IL-1β原核表达质粒,进行大肠杆菌表达和蛋白纯化,制备重组蛋白。采用细胞杂交瘤技术制备获得4株稳定分泌IL-1β单克隆抗体杂交瘤细胞株(1E2、2H3、5H3及7E7);4株单抗腹水ELISA效价高达1∶1024000;5H3单抗识别的抗原表位为149 DLKREVVFCM 158;1E2、2H3和7E7单抗所识别的抗原表位为202 KRYPKRD 208。脂多糖(LPS)小鼠炎症模型抗炎试验结果显示,相对LPS对照组,IL-1β单抗处理组小鼠血清NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量及临床症状评分显著降低,表明4株单抗均有较好抗炎效果,其中1E2单抗抗炎作用最优,为猪IL-1β阻断药物研究奠定了重要基础。 展开更多

关键词 IL-1Β 单克隆抗体 炎症治疗

下载PDF 职称材料

宿主细胞敲除G3BP2基因对塞内卡病毒复制的影响

3

作者 郭承意 董钰蓓 +4 位作者 温家成 延君芳 高雁怩 姜平 白娟 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2025年第1期91-97,共7页

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白2(G3BP2)基因敲除的293T细胞系,并初步探讨了G3BP2基因缺失对于塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)增殖的影响。采用激光共聚焦试验观察病毒感染是否引起应激颗粒的产生... 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白2(G3BP2)基因敲除的293T细胞系,并初步探讨了G3BP2基因缺失对于塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)增殖的影响。采用激光共聚焦试验观察病毒感染是否引起应激颗粒的产生;设计、构建靶向G3BP2基因的px459-sgRNA表达载体并转染进293T细胞;通过嘌呤霉素压力筛选以及亚克隆得到细胞株,经过Western blot、基因测序的方式鉴定细胞株;CCK-8法测定细胞增殖速度;Western blot、RT-qPCR、噬斑试验分别检测SVA感染后病毒蛋白VP1的表达水平、VP1的拷贝数和细胞上清液的病毒滴度;设计并构建SVA核糖体进入位点(IRES)的双荧光素酶报告系统,双荧光素酶报告试验测定病毒启动子的启动活性。结果:病毒感染引起应激颗粒的产生;筛选得到1株G3BP2基因缺失10 bp的293T细胞系(HEK 293T G3BP2^(-/-)),其细胞活力与未敲除细胞相比无显著差异;Western blot、RT-qPCR、噬斑试验均显示G3BP2敲除后显著抑制了病毒的增殖;双荧光素酶报告试验表明G3BP2敲除后下调了病毒的翻译启动活性。综上,本研究获得了1株HEK 293T G3BP2^(-/-)细胞系,该细胞通过下调病毒的启动活性抑制病毒的增殖,为进一步探讨G3BP2对SVA复制的影响奠定基础。 展开更多

关键词 G3BP2基因 基因敲除 塞内卡病毒A 复制

下载PDF 职称材料

新疆部分地区马疱疹病毒1型感染的血清学调查 被引量：4

4

作者 胡月 高雁怩 +5 位作者 加尔肯 车传忠 王旭蕾 姜平 冉多良 刘建华 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期845-850,共6页

旨在了解新疆地区马疱疹病毒1型感染的流行现状和特点,本研究于2019—2020年从新疆乌鲁木齐、昌吉州、伊犁州、巴州16处规模化马场收集1657份马血清样品,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行抗体检测,对不同地区、品种、性别及年龄马匹的... 旨在了解新疆地区马疱疹病毒1型感染的流行现状和特点,本研究于2019—2020年从新疆乌鲁木齐、昌吉州、伊犁州、巴州16处规模化马场收集1657份马血清样品,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行抗体检测,对不同地区、品种、性别及年龄马匹的马疱疹病毒1型抗体阳性率进行统计分析。结果显示,乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州马疱疹病毒1型抗体阳性率分别为39.34%、22.56%、90.52%、5.00%;纯血马、混血马、哈萨克马、伊犁马、焉耆马、普氏野马的EHV-1抗体阳性率分别为20.34%、32.93%、44.92%、19.35%、5.00%、90.52%;普氏野马与家马的EHV-1抗体阳性率分别为90.52%和29.32%;家马中新疆本土品种马与引进品种马的EHV-1抗体阳性率分别为31.70%和25.50%;母马与公马的EHV-1抗体阳性率分别为38.84%和22.00%;处于幼年、青年、成年、老年阶段的马匹EHV-1抗体阳性率分别为35.37%、33.00%、34.31%、23.81%。结果提示,新疆乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州规模化养殖场普遍存在EHV-1感染,且不同地区、品种、性别及年龄的马EHV-1感染率差异显著(P<0.05)。本研究为新疆地区EHV-1感染的探讨和防控工作提供调查数据。 展开更多

关键词 马疱疹病毒1型 酶联免疫吸附试验 血清学调查

下载PDF 职称材料

3′-U3区碱基突变不影响禽白血病病毒的体外复制能力 被引量：1

5

作者 高雁怩 高奇 +9 位作者 李晓菲 贠炳岭 祁小乐 王永强 刘长军 崔红玉 张艳萍 高宏雷 王笑梅 高玉龙 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期608-614,共7页

为探索近年蛋鸡分离株中出现规律性突变的J群禽白血病病毒(ALV-J)3′-U3区对病毒体外复制能力的影响,以ALV-J原型毒株HPRS-103为骨架,利用融合PCR技术构建含蛋鸡分离株SD09DP04的3′-U3区的嵌合病毒的cDNA克隆。嵌合病毒的感染性克隆与... 为探索近年蛋鸡分离株中出现规律性突变的J群禽白血病病毒(ALV-J)3′-U3区对病毒体外复制能力的影响,以ALV-J原型毒株HPRS-103为骨架,利用融合PCR技术构建含蛋鸡分离株SD09DP04的3′-U3区的嵌合病毒的cDNA克隆。嵌合病毒的感染性克隆与原型毒株HPRS-103的感染性克隆分别在脂质体介导下转染DF-1细胞,对收获的病毒分别用间接免疫荧光试验、禽白血病抗原和反转录酶试剂盒检测,结果表明成功拯救到2株病毒。对拯救的2株病毒,进行其3′-U3区启动子活性和增强子活性的检测,以及复制动力学比较分析结果显示,出现特异性规律性突变的U3区对于原毒株的体外复制能力无显著影响。所构建的3′-U3区的嵌合病毒的成功拯救对于进一步探索近年ALV-J流行毒株其3′-U3区出现的规律性突变的功能及意义奠定了基础。 展开更多

关键词 U3区 嵌合病毒 J亚群禽白血病病毒 生物学特性

下载PDF 职称材料

牛结节性皮肤病病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用 被引量：5

6

作者 伍子昂 南文龙 +6 位作者 吴晓东 王怡 王俊荣 高雁怩 白娟 杨振 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2022年第11期100-105,共6页

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和... 牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和重复性。结果发现,本方法敏感性达到15 copies/μL,不与其他牛病病毒和山羊痘弱毒疫苗AV41发生反应,变异系数均小于3%。用本方法和OIE推荐的普通PCR方法检测发病牛场94份临床样品,LSDV检出率分别为62%和37%,其中阳性样品2种方法检测符合率为96.7%,说明本方法敏感性、特异性和重复性较好,可用于LSDV检测。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR

下载PDF 职称材料

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立 被引量：3

7

作者 张路捷 高雁怩 +2 位作者 夏婷婷 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1509-1516,共8页

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测11... 本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准:当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA

下载PDF 职称材料

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒 被引量：1

8

作者 马梓承 刘星 +2 位作者 白娟 高雁怩 姜平 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第6期101-107,共7页

旨在构建伪狂犬病病毒(PRV)UL21基因缺失重组病毒。采用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白系统9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术,设计针对UL21的单导向RNA(sgRNA),并构建UL21基因左右两侧同源臂质粒(pUC19 UL21-Left-Right-GFP),将其与PR... 旨在构建伪狂犬病病毒(PRV)UL21基因缺失重组病毒。采用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白系统9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术,设计针对UL21的单导向RNA(sgRNA),并构建UL21基因左右两侧同源臂质粒(pUC19 UL21-Left-Right-GFP),将其与PRV基因组共转染HEK-293T细胞,通过蚀斑纯化获得PRV-ΔUL21病毒,并通过PCR和Western blot检测方法鉴定该毒株成功缺失了UL21基因。结果表明,CRISPR/Cas9技术可用于构建PRV基因缺失重组病毒,为PRV致病机制研究提供重要依据。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 UL21 CRISPR/Cas9 基因缺失

下载PDF 职称材料

某猪场非洲猪瘟临床病理变化及病毒组织分布观察 被引量：1

9

作者 夏婷婷 高雁怩 +3 位作者 白娟 王俊荣 张路捷 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第6期104-107,共4页

选择某疑似非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床发病猪场3头病死仔猪,系统观察其眼观病变、组织病理学变化,检测非洲猪瘟病毒(ASFV)及其在不同组织中的分布。结果显示:发病死亡仔猪内脏器官广泛出血与肿大,其中以淋巴结与脾脏病变最... 选择某疑似非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床发病猪场3头病死仔猪,系统观察其眼观病变、组织病理学变化,检测非洲猪瘟病毒(ASFV)及其在不同组织中的分布。结果显示:发病死亡仔猪内脏器官广泛出血与肿大,其中以淋巴结与脾脏病变最为显著。内脏器官组织学病理变化以广泛性的充血、出血及炎性细胞浸润为主。实时荧光定量PCR与免疫组化显示脾脏、淋巴结、肝脏和肺脏中病毒载量较大,心脏、肾脏和脑次之。组织中的病毒载量与组织病变程度具有一定相关性,证明ASFV感染猪体全身组织,可造成严重的血液循环障碍与炎症反应,为该病发病机理研究提供了理论依据。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 病理变化 病毒分布

下载PDF 职称材料

G3BP1^(-/-)293T细胞系的构建及其影响塞内卡病毒A复制的研究

10

作者 高雁怩 郭承意 +2 位作者 姜晓琳 赵栩 白娟 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期977-982,共6页

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲... 本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量RT-PCR方法检测SVA感染后基因组拷贝数,Western-blot检测病毒蛋白VP1表达水平;间接免疫荧光(IFA)检测敲除G3BP1基因对细胞内应激颗粒形成的影响。结果显示,筛选出1株G3BP1基因缺失5 bp的293T细胞(G3BP1-/-293T),其增殖速度与正常细胞相比未见显著差异;荧光定量RT-PCR结果和Western-blot结果表明,在病毒感染早期,敲除G3BP1基因显著抑制SVA基因组复制和病毒蛋白表达;IFA结果显示,敲除G3BP1基因不会影响其细胞内应激颗粒的形成,表明G3BP1对SVA复制的影响与应激颗粒的形成无关。综上,本研究获得1株G3BP1-/-293T细胞系,该细胞能够在病毒感染早期抑制SVA复制,为进一步研究G3BP1对SVA复制的影响奠定了基础。 展开更多

关键词 G3BP1基因 基因敲除 293T细胞 塞内卡病毒A 复制

下载PDF 职称材料

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞抗原表位的鉴定 被引量：2

11

作者 王俊荣 张路捷 +4 位作者 胡永新 吴晓东 白娟 高雁怩 姜平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期947-955,共9页

为了解析非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的抗原表位,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,以杆状病毒系统表达纯化的p30蛋白间接ELISA为单抗筛选方法,研制出12株单抗,细胞培养上清抗体效价均大于1∶6400。1G2单克隆抗... 为了解析非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的抗原表位,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,以杆状病毒系统表达纯化的p30蛋白间接ELISA为单抗筛选方法,研制出12株单抗,细胞培养上清抗体效价均大于1∶6400。1G2单克隆抗体的重链属于IgG2b,其余11株单抗的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western-blot和间接免疫荧光试验结果显示,这些单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。通过p30蛋白基因截短表达和Western-blot发现,这12株单抗分别识别4个抗原表位,包括11MEVIFKTDLRSS22,82EWNMILHVLFEEETES97,107KNDNETNECTSSFETL122,122LFEQEPSSEVPKDSKL137。本研究结果为非洲猪瘟病毒诊断和生物学研究提供了有用的生物学材料。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体 B细胞抗原表位

下载PDF 职称材料

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：13

12

作者 张路捷 高雁怩 +2 位作者 夏婷婷 白娟 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2021年第6期111-115,共5页

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的... 为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体

原文传递

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在昆虫细胞中的可溶性表达 被引量：4

13

作者 尹园英 高雁怩 +2 位作者 夏婷婷 白娟 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2021年第6期99-103,共5页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白是该病毒基因工程亚单位疫苗研究的重要靶向抗原,基因变异较大,且难以高效表达。本研究通过比对美洲型PRRSV 3种基因亚型的代表性毒株GP5蛋白的氨基酸序列,选取其同源性较高的氨基酸序列组合为杂合... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白是该病毒基因工程亚单位疫苗研究的重要靶向抗原,基因变异较大,且难以高效表达。本研究通过比对美洲型PRRSV 3种基因亚型的代表性毒株GP5蛋白的氨基酸序列,选取其同源性较高的氨基酸序列组合为杂合GP5(xGP5m),并在其N端分别添加3种穿膜肽序列(TAT、ppTG20、MPG),克隆至杆状病毒表达载体pFastBac^(TM)Dual,构建获得4株重组杆状病毒,Western blot、间接免疫荧光试验和小鼠试验结果显示,TAT能明显提高GP5蛋白的可溶性表达水平,且能增强小鼠对GP5蛋白的免疫应答能力,为PRRSV亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5 穿膜肽 杆状病毒表达系统

原文传递