人BMP-7及VEGF基因共表达腺病毒的构建及在兔骨髓基质干细胞中的共表达 被引量：4

1

作者 鱼兵 闫露 +2 位作者 范清宇 龙华 文艳华 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 2004年第21期1704-1707,共4页

目的构建人BMP7及VEGF165基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达。方法利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP7及VEGF165基因共表达腺病毒AdB7V,体外感染rBMSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RTPCR、免疫组化方法鉴定... 目的构建人BMP7及VEGF165基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达。方法利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP7及VEGF165基因共表达腺病毒AdB7V,体外感染rBMSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RTPCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达。结果rBMSC经AdB7V感染后72h可观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,RTPCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP7及VEGF165基因均可在rBMSC中表达。结论成功构建人BMP7及VEGF165基因共表达重组腺病毒,证实了其在rBMSC的表达,为骨再生的局部联合基因治疗打下基础。 展开更多

关键词 人BMP-7基因 VEGF基因 骨髓基质干细胞 腺病毒

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人骨形成蛋白-7基因在人骨髓间充质干细胞中的表达和对其分化表型的影响 被引量：3

2

作者 鱼兵 范清宇 +3 位作者 闫露 栗艳 文艳华 刘云燕 《医学研究生学报》 CAS 2004年第12期1068-1071,F030,共5页

目的 :观察人骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在人骨髓间充质干细胞 (hMSC)中的表达及对其成骨表型的影响。　方法 :利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP 7基因表达腺病毒AdB7V ,体外感染hMSC后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达及RT PCR、免疫组化方... 目的 :观察人骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在人骨髓间充质干细胞 (hMSC)中的表达及对其成骨表型的影响。　方法 :利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP 7基因表达腺病毒AdB7V ,体外感染hMSC后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达及RT PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达 ,通过对感染细胞的碱性磷酸酶 (ALP)染色和钙盐染色鉴定其成骨分化表型。　结果 :hMSC经AdB7V感染后 72h可观察到GFP表达 ,RT PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP 7在hMSC中表达 ,感染细胞的ALP染色和钙盐染色均为阳性。　结论 :外源性的人BMP 展开更多

关键词 人BMP-7基因 骨髓间充质干细胞 腺病毒 成骨分化

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Hsv-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因表达载体的构建与鉴定 被引量：5

3

作者 鱼兵 成诗银 张惠中 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第10期1019-1023,共5页

目的:构建含有Hsvtk、重组人IL2rhIL2、TNFαrhTNFα不同组合融合基因的逆转录病毒表达载体。方法:经分离人外周血单个核细胞peripheralbloodmononuclearcellPBMC总RNA,以反转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreactio... 目的:构建含有Hsvtk、重组人IL2rhIL2、TNFαrhTNFα不同组合融合基因的逆转录病毒表达载体。方法:经分离人外周血单个核细胞peripheralbloodmononuclearcellPBMC总RNA,以反转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreactionRTPCR制备人IL2互补DNAcomplementaryDNAcDNA模板。分别以PCR方法扩增3种基因,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆经鉴定后测序。将测序正确的各目的基因分别从测序载体相应酶切位点消化后,回收并纯化后与经相同双酶消化后的线性化PLXSN表达载体连接,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经筛选后随机挑取阳性菌落后,提取质粒酶切鉴定插入片段大小和位置以获得正确重组子。按上述定向克隆方法依次将各片段正向插入至PLXSN表达载体的多克隆位点间,以构建含不同融合基因的真核表达载体。结果:经限制性酶切分析及PCR方法鉴定,各插入基因及融合基因大小、位置、方向均正确无误。结论:Hsvtk、IL2、TNFα不同组合融合基因表达载体的成功构建为喉癌的基因治疗提供部分实验基础也为表达具有多功能活性的新型融合蛋白和发现细胞因子的新功能提供有利条件。 展开更多

关键词 HSV-TK基因 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子-α 融合基因 载体 喉癌 基因治疗

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人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达 被引量：2

4

作者 鱼兵 范清宇 +4 位作者 马保安 周勇 张明华 龙华 闫露 《第四军医大学学报》 北大核心 2004年第17期1537-1540,共4页

目的 :克隆人骨形成蛋白 7(BMP 7)基因并构建其重组腺病毒 ,观察其在兔BMSc中的表达 .方法 :用RT PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP 7基因全长cDNA并测序 ;将BMP 7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAd Track CMV BMP 7,经PmeI酶切线... 目的 :克隆人骨形成蛋白 7(BMP 7)基因并构建其重组腺病毒 ,观察其在兔BMSc中的表达 .方法 :用RT PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP 7基因全长cDNA并测序 ;将BMP 7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAd Track CMV BMP 7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier 1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP 7并酶切鉴定 ,PacI酶切线性化后转染 2 93细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP 7,将AdBMP 7体外感染兔BMSc后 ,以RT PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP 7基因的表达 .结果 :用RT PCR方法从胎肾组织中克隆出 1 2 96bp的cDNA ,测序证实为人BMP 7基因 ;酶切鉴定表明BMP 7基因已插入到 pAd Track CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒 pAdBMP 7构建成功 ;经 2 93细胞包装 3d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP) ,氯化铯梯度离心法最终获得约 3× 1 0 9efu/L滴度的重组病毒 ;体外感染兔BMSc后RT PCR方法及荧光显微镜证实BMP 7基因可在兔BMSc中表达 .结论 :成功克隆人BMP 7基因并构建其重组腺病毒 ,证实了其在BMSc的表达 。 展开更多

关键词 腺病毒 表达载体 人骨形成蛋白-7 基因克隆

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联合应用自杀基因和细胞因子基因对人喉癌抑制作用的实验研究(英文) 被引量：1

5

作者 鱼兵 成诗银 张惠中 《中国临床康复》 CSCD 2004年第14期2780-2781,F013,共3页

摘要背景:目前喉癌的治疗方法对于晚期复发和远隔转移病例难以获得满意效果,自杀基因联合免疫基因疗法可能能够长期提高肿瘤患者的生存率及生活质量。目的:构建含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)、重组人白介素2(rhIL-2)、肿瘤坏死... 摘要背景:目前喉癌的治疗方法对于晚期复发和远隔转移病例难以获得满意效果,自杀基因联合免疫基因疗法可能能够长期提高肿瘤患者的生存率及生活质量。目的:构建含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)、重组人白介素2(rhIL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(rhTNF-α)不同组合融合基因的反转录病毒表达载体,寻找一个更有利于患者生存期内不易复发、根治效果良好、有利于社会、心理、生活质量基因治疗的理论基础。设计:前瞻性实验研究。地点和对象:实验在第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成,对象为HSV-tk、白介素2(IL-2)、TNF-α融合基因。干预:以RT-PCR制备人IL-2cDNA,分别以PCR方法扩增3目的基因,扩增产物纯化、测序后以定向克隆方法依次将各片段正向插入至pLXSN表达载体的多克隆位点间,以构建含不同融合基因的真核表达载体。主要观察指标:各目的基因PCR扩增结果,目的载体的酶切鉴定,PCR鉴定目的载体。结果:pL(TIT)SN经EcoRI,BamHI双酶切得到大小约2.07kb融合基因片段,pL(TI)SN经EcoRI,XhoI酶切得到大小约1.58kb融合基因片段,pL(TT)SN经EcoRI,BamHI双酶切得到大小约1.59kb融合基因片段,pL(TK)SN经EcoRI,BamHI双酶切得到大小约1.13kb片段。经限制性酶切分析及PCR方法鉴定,各插入基因及融合基因大小、? 展开更多

关键词 基因 白细胞介素2 肿瘤坏死因子 基因表达

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人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

6

作者 鱼兵 范清宇 +1 位作者 闫露 文艳华 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期985-988,共4页

目的克隆人骨形成蛋白7(BM P-7)基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBM SC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性。方法用R T-PC R法从人胎肾组织中克隆人BM P-7基因全长cD N A并测序。将BM P-7基因cD N ... 目的克隆人骨形成蛋白7(BM P-7)基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBM SC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性。方法用R T-PC R法从人胎肾组织中克隆人BM P-7基因全长cD N A并测序。将BM P-7基因cD N A克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShut-tle-BM P-7,经鉴定后利用LipofectA M IN E2000瞬时转染rBM SC,用R T-PC R方法及免疫组化检测BM P-7基因的表达。结果用R T-PC R法从胎肾组织中克隆出1296bp的cD N A,测序证实为人BM P-7基因。R T-PC R方法及免疫组化检测证实其能在rBM SC中表达。结论成功克隆人BM P-7基因并证实其在rBM SC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础。 展开更多

关键词 骨形成蛋白7 基因克隆 骨髓基质干细胞 基因转染

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成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证 被引量：16

7

作者 高杰 杨彤涛 +4 位作者 裘秀春 鱼兵 韩建伟 范清宇 马保安 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第6期561-565,共5页

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系。本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验... 背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系。本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证。方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),多聚腺苷酸化和5′连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR4-TOPO载体上得到大约109bpDNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况。根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证。结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166)。选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达。结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系。 展开更多

关键词 骨肉瘤 SOSP-9607细胞系 MICRORNA 筛选 克隆 NORTHERN BLOT

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人转化生长因子β_1及骨形成蛋白7基因共表达载体的构建及对骨髓基质干细胞的定向诱导作用 被引量：7

8

作者 龙华 袁华 +3 位作者 马保安 鱼兵 范德刚 范清宇 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1224-1228,共5页

目的构建人转化生长因子1β(transform ing grow th factor1β,TGF-1β)及骨形成蛋白7(bonem orphogenetic prote in 7,BM P-7)基因共表达腺病毒真核表达载体,并观察感染骨髓基质干细胞(m arrow strom a l stemce lls,M SC s)后目的基... 目的构建人转化生长因子1β(transform ing grow th factor1β,TGF-1β)及骨形成蛋白7(bonem orphogenetic prote in 7,BM P-7)基因共表达腺病毒真核表达载体,并观察感染骨髓基质干细胞(m arrow strom a l stemce lls,M SC s)后目的基因的表达和对细胞生物学行为的影响。方法以复制缺陷的腺病毒A dE asy为基因载体,制备携带TGF-1β及BM P-7基因的高滴度腺病毒液感染人M SC s,通过免疫细胞化学、原位杂交、RT-PCR及己糖醛酸水平检测等方法鉴定外源基因的表达,分析外源性基因共表达对M SC s定向软骨分化的调控机制。结果腺病毒感染72 h后,TGF-1β和BM P-7免疫细胞化学染色可见大部份M SC s胞浆内均出现棕黄色粗颗粒,通过原位杂交检测出Ⅱ型胶原蛋白基因mRNA,感染10 d后细胞培养液中己糖醛酸含量为68.03±3.34μg/m l与感染前的53.20±3.70μg/m l明显升高有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建了人TGF-1β及BM P-7共表达基因腺病毒表达载体,证实其在M SC s中的表达和具有向软骨细胞定向分化的诱导作用,为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定实验基础。 展开更多

关键词 转化生长因子Β1 骨形成蛋白7 骨髓基质干细胞 软骨 基因治疗

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携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定 被引量：5

9

作者 张银刚 郭雄 +2 位作者 周京军 鱼兵 刘兵 《第一军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期30-32,36,共4页

目的探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-... 目的探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-PCR对其鉴定;以NIH3T3为靶细胞,对其滴度进行测定。结果荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞,在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6/8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。 展开更多

关键词 EGFP 重组逆转录病毒载体 荧光激活细胞分选技术 基因转染

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腺病毒介导TGF-β_1基因感染兔软骨细胞修复关节软骨缺损 被引量：4

10

作者 龙华 袁华 +3 位作者 马保安 鱼兵 裘秀春 范清宇 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第16期1239-1241,i0003,共4页

[目的]探讨腺病毒介导转化生长因子β1(TGF-β1)基因感染对兔关节软骨细胞增殖和分化的影响,观察其构建组织工程化软骨对关节软骨缺损的修复质量。[方法]以腺病毒Adeno-XTM为基因转移载体,制备携带TGF-β1基因的高滴度腺病毒液感染兔关... [目的]探讨腺病毒介导转化生长因子β1(TGF-β1)基因感染对兔关节软骨细胞增殖和分化的影响,观察其构建组织工程化软骨对关节软骨缺损的修复质量。[方法]以腺病毒Adeno-XTM为基因转移载体,制备携带TGF-β1基因的高滴度腺病毒液感染兔关节软骨细胞,通过光电镜、免疫细胞化学、Northern杂交及流式细胞仪分析细胞周期等方法观察软骨细胞形态、增殖及外源基因的表达。再将其与骨基质明胶(BMG)支架相复合移植修复同种异体关节软骨缺损。[结果]腺病毒感染软骨细胞后免疫细胞化学染色可检测出外源基因编码蛋白的表达,Northern杂交显示Ⅱ型胶原表达水平增加,TGF-β1的表达显著增加了原代软骨细胞S/G2/M期细胞比例。将其复合于骨基质明胶上,经组织染色和电镜观察可见软骨细胞贴附于BMG表面和孔隙内大量增殖,在体移植修复实验组新生组织为透明软骨,关节面平整,软骨下骨完全重建再生。[结论]软骨细胞经携带TGF-β1基因的腺病毒感染后,能促进软骨细胞的增殖,可用于制备组织工程化软骨。 展开更多

关键词 关节软骨细胞 腺病毒载体 转化生长因子Β 组织工程

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人骨形成蛋白7基因修饰的兔骨髓基质干细胞异位成骨实验 被引量：5

11

作者 闫露 罗二平 +3 位作者 鱼兵 栗艳 沈敏 范清宇 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期137-140,共4页

[目的]通过人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein 7,BMP7)基因修饰的兔骨髓基质干细胞(m esenchymal stem cells,MSCs)与聚乳酸-羟基乙酸(polycleclide-co-plycoclide,PLGA)支架复合,进行自体皮下异位成骨实验,探索BMP-7基... [目的]通过人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein 7,BMP7)基因修饰的兔骨髓基质干细胞(m esenchymal stem cells,MSCs)与聚乳酸-羟基乙酸(polycleclide-co-plycoclide,PLGA)支架复合,进行自体皮下异位成骨实验,探索BMP-7基因治疗与组织工程技术相结合的可行性。[方法]PLGA与腺病毒Ad-BMP-7感染后的兔MSCs共培养,电镜观察了解细胞在PLGA上黏附、生长和合成分泌骨基质成分的情况;将转染基因的细胞和未转染基因的细胞分别与PLGA支架复合,构建组织工程化骨并植入体内,通过组织观察新骨形成情况。[结果]制备得到的PLGA为疏松多孔的网格样结构,具有一定的韧性和强度。将腺病毒感染的骨髓基质干细胞接种于修剪成一定形状的PLGA上,经电镜观察可见细胞贴附于材料表面和孔隙内并增殖。异位成骨实验证实空白对照PLGA孔隙内无新骨形成,对照细胞组内有部分新生骨形成,而Ad-BMP-7实验组形成的新生骨组织面积更大(P<0.05)。[结论]应用hBMP-7基因修饰的MSCs作为骨组织工程的种子细胞,可望取得更强的成骨能力。 展开更多

关键词 基因治疗 骨形成蛋白 组织工程

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HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究 被引量：3

12

作者 刘志 成诗银 鱼兵 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期582-585,共4页

目的　研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法　构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外... 目的　研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法　构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果　Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论　人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。 展开更多

关键词 HSV-TK/GCV自杀基因系统 喉癌 细胞杀伤作用 体外研究 基因治疗 更昔洛韦

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Hsv-tk、重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达 被引量：4

13

作者 成诗银 鱼兵 张惠中 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2002年第8期20-23,28,共5页

目的 :构建 pEGFP -TK -rhTNF -α表达载体 ,观察其在喉癌细胞Hep - 2中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体 pGEM -T -Easy测序 ,利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK -rhTNF -... 目的 :构建 pEGFP -TK -rhTNF -α表达载体 ,观察其在喉癌细胞Hep - 2中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体 pGEM -T -Easy测序 ,利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK -rhTNF -α并将其亚克隆至pEGFP -N3的EcoRI和BamHI位点间 ,成功构建表达载体 pEGFP -TK -rhTNF -α ,并在该载体转染人喉癌细胞Hep - 2后观察融合蛋白表达情况。结果 :酶切鉴定证实TK -rhTNF -α融合基因片段已克隆到pEGFP -N3的EcoRI和BamHI位点间 ,并在转染人喉癌细胞Hep - 2中观察到TK -rhTNF -α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论 :pEGFP -TK -rhTNF -α表达载体便于观察转染细胞中TK -rhTNF -α融合蛋白的表达情况及蛋白定位 。 展开更多

关键词 HSV-TK基因 肿瘤坏死因子-Α 融合基因 表达

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家兔骨髓基质细胞培养后与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的相容性 被引量：2

14

作者 赵勤鹏 范清宇 鱼兵 《中国临床康复》 CSCD 北大核心 2005年第46期22-23,共2页

目的:建立一套体外分离培养骨髓基质干细胞的方法,观察骨髓基质细胞的形态和生长规律,检测与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的细胞相容性。方法:实验于2004-10/2005-04在解放军第四军医大学唐都医院骨实验室完成。选取健康30d龄家兔40只,取幼... 目的:建立一套体外分离培养骨髓基质干细胞的方法,观察骨髓基质细胞的形态和生长规律,检测与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的细胞相容性。方法:实验于2004-10/2005-04在解放军第四军医大学唐都医院骨实验室完成。选取健康30d龄家兔40只,取幼兔长骨骨髓进行培养,观察其传代细胞生长特性和生长曲线。应用组织培养技术,对兔骨髓基质干细胞和聚乳酸-聚乙醇酸体外联合培养,相差显微镜观察和扫描电镜观察细胞生长情况。结果:实验纳入家兔40只,全部进入结果分析。①骨髓基质细胞不同接种时间的形态学观察:接种24h后可见大量密集的造血系细胞,有少量散在分布的贴壁细胞,呈多角形、短梭形;第3天可见形态各异、大小不一的贴壁细胞;第7天数量加速生长,己形成成纤维细胞集落,大部分细胞呈梭形,少部分呈多角形;第12天细胞融合成单层,从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列。②骨髓基质细胞接种72h后扫描电镜观察结果:早期可见培养板内细胞增多,并向聚乳酸-聚乙醇酸材料移行贴附于材料周边,部分细胞直接贴附于材料表面,随复合培养时间的延长而增多,细胞形态多为梭形及三角形,无细胞衰老及异常分裂现象。结论:兔骨髓基质细胞在体外培养条件下,早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,可作为骨组织工程学的种子细胞。聚乳酸-聚乙醇酸具有良好的细胞相容性,可作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的实验。 展开更多

关键词 骨髓细胞 生物相容性材料 乳酸盐类 聚西托醇 生物医学工程

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HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因对喉癌细胞Hep-2杀伤作用的体外研究 被引量：1

15

作者 成诗银 张惠中 鱼兵 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2002年第2期85-89,共5页

目的:观察自杀基因HSV-tk与不同细胞因子基因(IL-2、TNF-α)构建的不同融合基因表达产物对喉癌细胞系的体外杀伤作用。方法:分别构建不同融合基因逆转录表达载体PL(TI)SN,PL(N)SN,PL(TK)SN,在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细... 目的:观察自杀基因HSV-tk与不同细胞因子基因(IL-2、TNF-α)构建的不同融合基因表达产物对喉癌细胞系的体外杀伤作用。方法:分别构建不同融合基因逆转录表达载体PL(TI)SN,PL(N)SN,PL(TK)SN,在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将各重组病毒分别感染人喉癌细胞系Hep-2,G418筛选出抗性克隆,分别命名为Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK,以RT-PCR及Southern blot检测各融合基因的整合及表达。通过观察各基因修饰细胞生长状况及GCV杀伤实验鉴定融合基因的表达及杀伤效应。结果:RT-PCR及South-ern blot分析证明各重组外源基因在人喉癌细胞系Hep-2中均有整合及表达。Hep/TI,HeP/TK生长速度无明显差别,Hep/TT细胞增殖速度受到抑制。在GCV杀伤试验中,Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK均显示出对GCV的高敏感性,其中GCV对Hep/TT的杀伤作用最为明显,各基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合,均显示出明显旁观者效应。结论:自杀基因与细胞因子基因共表达体系对喉癌细胞系Hep-2体外杀伤具有协同作用,并且有明显的旁观者效应,可望成为肿瘤基因治疗的新途径。 展开更多

关键词 HEP-2 杀伤作用 喉癌 HSV-TK基因 细胞因子 基因治疗

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人骨形成蛋白-7基因增强的组织工程化骨修复骨缺损 被引量：1

16

作者 闫露 鱼兵 +1 位作者 范清宇 文艳华 《实用医学杂志》 CAS 2006年第23期2724-2726,共3页

目的:探讨腺病毒介导人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)与聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)生物材料复合后修复兔桡骨缺损的效果。方法:制备含hBMP-7基因的重组腺病毒Ad-BMP-7并感染MSCs。制备新西兰大白兔桡骨1.3cm缺损模... 目的:探讨腺病毒介导人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)与聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)生物材料复合后修复兔桡骨缺损的效果。方法:制备含hBMP-7基因的重组腺病毒Ad-BMP-7并感染MSCs。制备新西兰大白兔桡骨1.3cm缺损模型,修复实验分为4组,BMP-7基因转染的MSCs-PLGA复合物组(A组)、未经转染的MSCs复合PLGA修复组(B组)、单纯PLGA修复组(C组)和对照组(D组)。分别于术后8、12周进行大体观察、X线检测和组织学检测。结果:定量检测分析结果证实经转染的MSCs修复骨缺损的成骨速度和成骨量均优于未转染组,单纯PLGA组和对照组均未见骨缺损得到骨性修复。结论:hBMP-7基因转染能够提高MSCs形成组织工程化骨组织和修复骨缺损的能力。 展开更多

关键词 骨疾病 骨缺损 骨形态发生蛋白 基因转染

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定量超声技术评估组织工程骨修复家兔桡骨的骨强度 被引量：1

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作者 赵勤鹏 范清宇 鱼兵 《中国临床康复》 CSCD 北大核心 2005年第30期80-81,共2页

目的:应用定量超声技术评估应用组织工程骨修复的家兔桡骨骨强度,探讨其成骨活性以及矿化规律。方法:实验于2004-04/2005-01在第四军医大学唐都医院骨实验室完成。选取健康30d龄家兔40只,随机分为两组,即聚乳酸-聚乙醇酸+骨髓基质细胞组... 目的:应用定量超声技术评估应用组织工程骨修复的家兔桡骨骨强度,探讨其成骨活性以及矿化规律。方法:实验于2004-04/2005-01在第四军医大学唐都医院骨实验室完成。选取健康30d龄家兔40只,随机分为两组,即聚乳酸-聚乙醇酸+骨髓基质细胞组,聚乳酸-聚乙醇酸组,20只/组。聚乳酸-聚乙醇酸+骨髓基质细胞组家兔自体骨髓基质细胞移植到预制形状的聚羟乙酸-乳酸中,体外复合培养1周后移植修复家兔桡骨15mm的缺损;聚乳酸-聚乙醇酸组采用单纯聚乳酸-聚乙醇酸对家兔桡骨骨缺损进行修复,未加入骨髓基质干细胞。对两组家兔的新生组织进行组织学、生物化学及放射线检查,12周后见新生骨完全填充了缺损,组织学显示其成骨过程为软骨内成骨。然后分别于12,16,22周对两组进行骨超声评估,测量超声波在桡骨中的传播速度。结果:实验纳入40只家兔全部进入结果分析。两组家兔骨缺损模型不同时期超声波在桡骨中的传播速度值的比较:①聚乳酸-聚乙醇酸+骨髓基质细胞组与聚乳酸-聚乙醇酸组在骨修复后12,16,22周均逐渐升高[(2890±99),(3010±108),(3106±116)m/s;(2720±96),(2910±101),(3100±98)m/s;P均<0.05]。②第12,16周聚乳酸-聚乙醇酸+骨髓基质细胞组传播速度值明显比聚乳酸-聚乙醇酸组快(P均<0.05);而第22周时两组传播速度值基本接近(P>0.05)。结论:应用定量超声技术检测到家兔桡骨骨缺损修复后不同时期的超声波在骨骼中的传播速度值,成骨活性呈动态变化,矿物质含量及骨强度均随时间的延长而升高,反映了修复后的骨髓基质细胞其组织工程骨的成骨能力增加。聚乳酸-聚乙醇酸+骨髓基质细胞组成骨活性、骨内矿物质含量及骨强度在骨修复后12,16周明显高于聚乳酸-聚乙醇酸组,至22周时两组成骨活性接近稳定,其骨强度大致相同。提示定量超声技术为组织工程骨的生物力学强度检测确定了一种新的方法。 展开更多

关键词 桡骨/损伤 骨髓细胞 骨密度 生物医学工程 超声检查

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急性心肌梗死患者血浆可溶性E-选择素的检测及其临床意义 被引量：1

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作者 刘松岩 杨欣国 +1 位作者 侯允天 鱼兵 《心脏杂志》 CAS 2002年第6期491-493,共3页

目的 :探讨心肌缺血 /再灌注与血管内皮急性炎症之间的关系及其与急性心肌梗死 (AMI)发病形式的关系。方法 :受试者分为 AMI组 4 3例 (发病 6 h内 ) ,其中 2 2例梗死前有不稳定心绞痛史 ,2 1例为猝发梗死 ;稳定劳力型心绞痛 (SEA)组 39... 目的 :探讨心肌缺血 /再灌注与血管内皮急性炎症之间的关系及其与急性心肌梗死 (AMI)发病形式的关系。方法 :受试者分为 AMI组 4 3例 (发病 6 h内 ) ,其中 2 2例梗死前有不稳定心绞痛史 ,2 1例为猝发梗死 ;稳定劳力型心绞痛 (SEA)组 39例。AMI组分别于入院时、再灌注后即刻、入院后 4 ,8,12 ,2 4 h及 2 ,3,5 d和 1,2周时抽外周静脉血测血浆可溶性 E-选择先 (s E- SL T)。SEA组于入院时空腹及仰卧位抽外周静脉血测血浆 s E- SL T。结果 :入院时 AMI组血浆 s E- SL T水平高于 SEA组 (39.2± 2 .9vs 2 7.8± 2 .1μg/ L ,P<0 .0 1)。另外 ,入院时梗死前前驱症状为不稳定心绞痛的 AMI患者血浆 s E- SL T水平还高于猝发梗死者 (45 .6± 5 .7vs32 .8± 1.9μg/ L,P<0 .0 5 )。AMI患者梗死前前驱症状为不稳定心绞痛者及猝发梗死者的血浆 s E- SL T水平随时间推移均缓慢下降 (相应从4 5 .6± 5 .7到 32 .7± 2 .5 μg/ L,P<0 .0 1和从 32 .8± 1.9到 2 1.5± 1.6 μg/ L,P<0 .0 1) ,而且前者的血浆 s E- SL T水平各时段均高于后者 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1)。结论 :AMI患者血浆 s E- SL T水平升高反映了血管内皮细胞活性增强。梗死前前驱症状为不稳定心绞痛的 AMI患者血浆 s E- SL T水平升高 。 展开更多

关键词 急性心肌梗塞 可溶性E-选择素 心肌缺血 再灌注损伤 血管内皮细胞

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HCCR-2基因的克隆及原核表达

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作者 栗艳 闫露 +1 位作者 鱼兵 沈敏 《西南国防医药》 CAS 2007年第1期1-3,共3页

目的：克隆HCCR-2基因、原核表达并鉴定。方法：从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA，经RT—PCR获得HCCR-2基因。将该基因克隆到pGEM—T—Easy克隆载体中，测序、鉴定。将测序正确的HCCR-2基因亚克隆到pET-28a（＋）表达载体中... 目的：克隆HCCR-2基因、原核表达并鉴定。方法：从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA，经RT—PCR获得HCCR-2基因。将该基因克隆到pGEM—T—Easy克隆载体中，测序、鉴定。将测序正确的HCCR-2基因亚克隆到pET-28a（＋）表达载体中，构建HCCR-2表达载体，IPTG诱导表达1～5h，做SDS—PAGE分析，鉴定HCCR-2蛋白的表达。结果：DNA测序证明，获得了HCCR-2基因，其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS—PAGE分析表明，HCCR-2蛋白获得高效表达，其相对分子质量为39kDa，表达量约占菌体总蛋白的25％。结论：HCCR-2基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨HCCR基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。 展开更多

关键词 HCCR 逆转录PCR 基因表达

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SRG基因的克隆及原核表达

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作者 闫露 高萍 +1 位作者 栗艳 鱼兵 《现代肿瘤医学》 CAS 2007年第3期304-306,共3页

目的克隆SRG基因、原核表达并鉴定。方法从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得SRG基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的SRG基因亚克隆到pET-28(a+)表达载体中,构建SRG表达载体,IPTG... 目的克隆SRG基因、原核表达并鉴定。方法从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得SRG基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的SRG基因亚克隆到pET-28(a+)表达载体中,构建SRG表达载体,IPTG诱导表达2h^6h,做SDS-PAGE分析,鉴定SRG蛋白的表达。结果DNA测序证明,获得了SRG基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,SRG蛋白获得高效表达,其相对分子质量为22kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论SRG基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨SRG基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。 展开更多

关键词 SRG基因 逆转录PCR 基因表达

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