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水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
1
作者 盛陈艳 麻宝艺 +7 位作者 李健明 宫庆龙 刘菲 时坤 孙志博 刘艺 冷雪 杜锐 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期131-138,共8页
为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关... 为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 水貂圆环病毒 Cap基因 SYBR Green II实时荧光定量PCR方法
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PCV3吉林野毒株全基因组序列分析及其Cap蛋白的亚细胞定位
2
作者 刘东旭 刘宏莹 +5 位作者 苏诺 葛桂阳 麻宝艺 盛陈艳 李东丽 刘艺 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第4期27-32,共6页
为了研究吉林省猪圆环病毒3型(PCV3)野毒株遗传变异情况及其衣壳蛋白(Cap)的亚细胞定位特征,本试验对收集到的10株PCV3吉林野毒株进行全基因组序列测定和分析,并构建真核表达载体pcDNA3.1V5/HisA-Cap转染猪肺巨噬细胞(PAM);继而用本实... 为了研究吉林省猪圆环病毒3型(PCV3)野毒株遗传变异情况及其衣壳蛋白(Cap)的亚细胞定位特征,本试验对收集到的10株PCV3吉林野毒株进行全基因组序列测定和分析,并构建真核表达载体pcDNA3.1V5/HisA-Cap转染猪肺巨噬细胞(PAM);继而用本实验室已构建的兔源PCV3-Cap多克隆抗体,通过激光共聚焦检测Cap蛋白在PAM中的定位。序列分析结果显示,10株PCV3吉林野毒株与国内外参考株之间的全基因组核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,处于PCV3a和PCV3b两个亚群;基因重组分析结果显示,仅中国参考株MF589102(2016年)、MH445396(2019年)和分离株JL-2在80~303 nt、840~1196 nt和1885~2001 nt处发生3处重组。激光共聚焦检测结果显示,Cap蛋白大部分定位于细胞核,少部分定位于细胞质。结果表明,目前吉林省PCV3比较保守,没有出现较大变异,Cap蛋白在PAM的细胞核和细胞质中均有分布。 展开更多
关键词 野毒株 猪圆环病毒3型 CAP蛋白 亚细胞定位
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BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4
3
作者 麻宝艺 盛陈艳 +6 位作者 刘宏莹 马青霞 汪婷婷 李健明 时坤 杜锐 冷雪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2326-2335,共10页
【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件... 【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) TaqMan实时荧光定量PCR方法 探针
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水貂阿留申病毒诱导CrFK细胞凋亡信号通路的研究 被引量：3
4
作者 葛桂阳 栾美慧 +8 位作者 宫庆龙 刘艺 李东丽 麻宝艺 盛陈艳 时坤 李健明 冷雪 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1089-1095,共7页
本实验室前期研究表明水貂阿留申病毒(AMDV)G株感染猫肾细胞(CrFK)可以引起其凋亡,为研究AMDV在体外通过何种途径诱导CrFK细胞的凋亡,本实验采用MOI 1的AMDV G株感染CrFK细胞,于感染后不同时间(2 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h,下同... 本实验室前期研究表明水貂阿留申病毒(AMDV)G株感染猫肾细胞(CrFK)可以引起其凋亡,为研究AMDV在体外通过何种途径诱导CrFK细胞的凋亡,本实验采用MOI 1的AMDV G株感染CrFK细胞,于感染后不同时间(2 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h,下同)通过分光光度法检测试剂盒检测Caspase-8、Caspase-9的活性;利用western blot检测Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达情况。采用Caspase-8和Caspase-9抑制剂处理CrFK细胞后感染AMDV G株,于不同时间检测Caspase-3的活性。于AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间,利用荧光定量PCR检测细胞中死亡受体通路分子Caspase-8、Fas、FasL和线粒体通路分子Caspase-9、Bax、Bcl-2、Cyt C以及凋亡执行因子Caspase-3的mRNA转录水平;采用JC-10线粒体膜电位试剂盒检测各时间点细胞线粒体膜电位的去极化情况。结果显示,AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8的活性均无明显变化,而Caspase-9的活性则随感染时间的延长而明显增强;western blot结果显示,Caspase-8蛋白的表达不受影响,而Caspase-9在AMDV感染后12 h被切割活化。Caspase-3活性的检测结果显示,抑制CrFK细胞中Caspase-8的活性后再感染AMDV,Caspase-3的活性逐渐增强,而抑制细胞中Caspase-9的活性后再感染AMDV,则Caspase-3的活性无明显变化,即抑制了Caspase-9再感染AMDV并不能诱导细胞凋亡;荧光定量PCR结果显示,AMDV感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8、Fas、FasL基因的转录水平均无明显变化,而Caspase-9、Caspase-3、Cyt C基因mRNA转录水平及Bax/Bcl-2的比值则随感染时间的延长而逐渐升高。线粒体膜电位结果显示,AMDV感染的CrFK细胞线粒体膜电位下降,发生了明显去极化现象,表现为细胞发生了凋亡。综上,本研究首次证实AMDV G株感染CrFK细胞后激活了线粒体途径的细胞凋亡执行分子Caspase-3及线粒体通路相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-9和Cyt C,并未激活死亡受体通路相关分子,AMDV G株是通过激活细胞线粒体通路而诱导CrFK细胞的凋亡。本研究为AMDV感染CrFK细胞凋亡机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 CrFK细胞 凋亡 信号通路
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猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其部分毒力基因序列遗传变异分析 被引量：4
5
作者 徐宁 葛桂阳 +8 位作者 李东丽 刘艺 宫庆龙 麻宝艺 盛陈艳 时坤 李健明 冷雪 杜锐 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第5期1794-1803,共10页
为了解吉林省猪伪狂犬病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究将采集自吉林省疑似发生猪伪狂犬病的临床样品,通过细胞传代、PCR检测和测序分析进行病毒分离鉴定。TCID50法测定分离毒株的病毒滴度,通过家兔感染试验测定分离毒株对家兔的致病性。... 为了解吉林省猪伪狂犬病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究将采集自吉林省疑似发生猪伪狂犬病的临床样品,通过细胞传代、PCR检测和测序分析进行病毒分离鉴定。TCID50法测定分离毒株的病毒滴度,通过家兔感染试验测定分离毒株对家兔的致病性。对TK、gB、gC、gD和gE基因进行PCR扩增和测序,分析其遗传变异情况。结果表明,临床样品经PK15细胞传代后,有3份样品出现细胞病变,经PCR鉴定和测序分析表明,分离获得3株PRV,分别命名为PRV JL03、JL12和JL15株。通过PK15细胞测定分离毒株的病毒滴度分别为10^(6.5)、10^(6.5)和10^(7.5)TCID50/mL。6只家兔分别接种3株分离毒株(10^(3.5)TCID50/只)后均表现为体温升高、注射部位奇痒和四肢麻痹等症状,且于病毒接种后3~4 d全部死亡。3株分离病毒TK、gB、gC、gD和gE基因推导氨基酸序列分析结果表明,与参考毒株相比,分离株TK基因未发生氨基酸变异;gB、gC、gD和gE基因部分位点发生氨基酸缺失、插入或突变,其中gE基因在第48和496位分别存在1个天冬氨酸的插入,与国内报道的流行毒株变异特征一致。遗传进化树分析结果表明,3株分离毒株TK、gB、gC、gD和gE基因与国内2012年以后分离的参考毒株JS-2012和ZJ01等的上述基因均表现出较高的同源性,说明毒株间亲缘关系较近,位于同一分支;与国外分离毒株NIA3和Becker等亲缘关系较远,位于不同的分支;而与国内早期流行的毒株SC和Ea等亲缘关系介于二者之间。本研究成功分离鉴定了3株PRV变异株,分离毒株对家兔具有较强的致病性,该结果为吉林省PRV流行病学研究提供了新的数据,并为相关后续研究奠定基础。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 分离鉴定 遗传变异分析
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CpG ODN重组质粒对猪外周血淋巴细胞免疫刺激作用的研究 被引量：1
6
作者 张进进 伭婷 +8 位作者 夏辉 盛陈艳 麻宝艺 马青霞 刘雅馨 高沙沙 杜锐 冷雪 周宇 《中国兽药杂志》 2020年第2期59-64,共6页
为获得对猪具有免疫刺激活性的含CpG序列的重组质粒,设计合成了11条CpG序列,应用MTS比色法测定合成CpG ODNs刺激猪PBMC增殖的能力,结果有10条CpG ODN对猪PBMC具有刺激活性(SI>2);以对猪PBMC具有较高刺激活性的CpG06和CpG08为核心,分... 为获得对猪具有免疫刺激活性的含CpG序列的重组质粒,设计合成了11条CpG序列,应用MTS比色法测定合成CpG ODNs刺激猪PBMC增殖的能力,结果有10条CpG ODN对猪PBMC具有刺激活性(SI>2);以对猪PBMC具有较高刺激活性的CpG06和CpG08为核心,分别合成含6次重复序列的重组质粒pCpG06和pCpG08,并检测其对猪PBMC的刺激活性,结果重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC的刺激指数分别可达4.97和5.32,并可刺激猪PBMC产生较高水平的IL-4。研究获得的重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC具有较好的刺激活性,可为猪用CpG佐剂的研究提供参考。 展开更多
关键词 CPG ODN 重组质粒 佐剂
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水貂阿留申病毒研究进展 被引量：1
7
作者 葛桂阳 李东丽 +9 位作者 徐宁 栾美慧 郜艳雪 刘艺 宫庆龙 麻宝艺 盛陈艳 孙志博 冷雪 杜锐 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2276-2280,共5页
水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的一种慢性、进行性传染病,是危害世界养貂业的重要疫病之一。由于AMDV具有抗体依赖性增强作用和特殊的致病机制,目前尚未开发出有... 水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的一种慢性、进行性传染病,是危害世界养貂业的重要疫病之一。由于AMDV具有抗体依赖性增强作用和特殊的致病机制,目前尚未开发出有效的疫苗。本文从AMDV的起源、遗传进化、宿主范围、传播途径和病毒的复制机制等几方面对AMDV的研究现状进行探讨,为今后AMD的致病机制及防控的研究提供参考。 展开更多
关键词 细小病毒 水貂阿留申病毒 遗传进化
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