鹅星状病毒XX株的分离鉴定及遗传特征分析 被引量：7

1

作者 金前跃 郭永刚 +7 位作者 李俊朋 秦保亮 王寅彪 郭振华 王丽 邢广旭 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2021年第6期134-141,共8页

为研究引起雏鹅痛风疫情的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)河南流行株的基因组特征,从患有痛风的雏鹅样品中分离了1株GAstV,命名为XX株,并对分离毒株进行了全基因组测序和遗传特征分析。结果显示,GAstV XX株可在LMH细胞上稳定传代,... 为研究引起雏鹅痛风疫情的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)河南流行株的基因组特征,从患有痛风的雏鹅样品中分离了1株GAstV,命名为XX株,并对分离毒株进行了全基因组测序和遗传特征分析。结果显示,GAstV XX株可在LMH细胞上稳定传代,但无明显的细胞病变;该毒株基因组全长7252 bp,与代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的基因组核苷酸序列同源性分别为98.1%、98.7%、98.7%。系统进化分析结果显示,GAstV XX株与GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01等毒株处于同一进化分支,属于禽星状病毒1群。ORF2编码蛋白氨基酸序列分析结果显示,与已报道的GAstV流行毒株相比,GAstV XX株存在多个氨基酸位点的突变。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 分离鉴定 全基因组测序 遗传特征 同源性 系统进化分析

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大豆胰蛋白酶抑制因子的危害及其检测研究进展 被引量：9

2

作者 王耀 吴佳蓓 +3 位作者 王珍玉 李燕虹 邓瑞广 胡骁飞 《饲料工业》 北大核心 2019年第13期61-64,共4页

大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆中一类主要的抗营养因子,其主要危害表现在致使胰腺增生、肿大以及抑制动物生长等方面。近年来,针对大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法已成为研究热点。文章通过对大豆胰蛋白酶抑制因子的危害和现有的检测方法... 大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆中一类主要的抗营养因子,其主要危害表现在致使胰腺增生、肿大以及抑制动物生长等方面。近年来,针对大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法已成为研究热点。文章通过对大豆胰蛋白酶抑制因子的危害和现有的检测方法进行综述,旨在为大豆及其制品中胰蛋白酶抑制因子的监控以及建立大豆胰蛋白酶抑制因子快速、高效的检测方法提供参考。 展开更多

关键词 大豆 胰蛋白酶抑制因子 危害 检测方法 免疫检测

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禽腺病毒4型ZZ株的分离鉴定及系统进化分析 被引量：5

3

作者 金前跃 王寅彪 +6 位作者 柴永笑 卢清侠 李鹏 郭振华 邢广旭 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2020年第11期128-133,共6页

为深入研究禽腺病毒4型(FAdV-4)河南流行株的基因组特征和分子进化关系,从患有心包积水综合征的病鸡样品中分离了1株FAdV-4(FAdV-4 ZZ),并对分离毒株进行了全基因组序列分析和分子进化分析。结果表明,FAdV-4 ZZ株可在鸡肝癌细胞上稳定... 为深入研究禽腺病毒4型(FAdV-4)河南流行株的基因组特征和分子进化关系,从患有心包积水综合征的病鸡样品中分离了1株FAdV-4(FAdV-4 ZZ),并对分离毒株进行了全基因组序列分析和分子进化分析。结果表明,FAdV-4 ZZ株可在鸡肝癌细胞上稳定传代并产生明显的细胞病变。与无毒力的FAdV-4 ON1株和FAdV-4 KR5株相比,FAdV-4 ZZ株以及国内流行的CH/JSXZ/2015、JSJ13、SDSX1株均存在ORF19、ORF27、ORF30基因缺失。与国内首次分离的JSJ13株相比,FAdV-4 ZZ株的ORF29序列存在33个碱基缺失。FAdV-4 ZZ株的Hexon基因与国内流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列相似性均为100%,与ON1株和KR5株的Hexon基因核苷酸序列相似性分别为98.69%和98.90%。综上,成功分离了FAdV-4 ZZ株,并获得了分离毒株的全基因组序列及其与国内外相关毒株的分子进化关系。 展开更多

关键词 禽腺病毒 血清4型 分离鉴定 全基因组 系统进化分析

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免疫分析技术在“新型瘦肉精”残留检测中的应用 被引量：5

4

作者 王耀 曹金博 +5 位作者 陈曦 李燕虹 陈秀金 李兆周 邓瑞广 胡骁飞 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期231-235,共5页

近年来,一些"新型瘦肉精"药物被非法用于畜禽养殖,如苯乙醇胺A、赛庚啶、可乐定等,该类药物添加在饲料和动物饮水中能有效促进禽畜生长,提高瘦肉率,降低养殖成本,但其在肉制品中的残留会对人体产生蓄积毒性。免疫分析技术利... 近年来,一些"新型瘦肉精"药物被非法用于畜禽养殖,如苯乙醇胺A、赛庚啶、可乐定等,该类药物添加在饲料和动物饮水中能有效促进禽畜生长,提高瘦肉率,降低养殖成本,但其在肉制品中的残留会对人体产生蓄积毒性。免疫分析技术利用高亲和力抗体对抗原进行特异识别,灵敏度高,是目前快速检测方法研究的热点之一,已在"传统瘦肉精"的快速检测中成熟应用,但其在"新型瘦肉精"快速检测中的应用仍处于起步阶段。该文对免疫分析技术在"新型瘦肉精"残留检测中的应用进行综述,并对其未来发展方向进行展望。 展开更多

关键词 新型瘦肉精 免疫分析 应用

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H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用 被引量：4

5

作者 李青梅 郭军庆 +8 位作者 孟泽锟 李艳华 刘肖 石建州 李鸽 柴书军 罗俊 邓瑞广 张改平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第10期3761-3769,共9页

为建立H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免... 为建立H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^(-4)至2.56×10^(-5)之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验(HI)显示血凝抑制活性,其(HI)效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6400、1∶25600和1∶25600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验(HA)相当,与其他亚型AIV(H1、H3、H5、H7),以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。 展开更多

关键词 H9N2亚型禽流感病毒 单克隆抗体 血凝抑制 病毒中和 免疫层析试纸条

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高亲和力大豆凝集素单抗制备及免疫学特性鉴定 被引量：3

6

作者 胡骁飞 李燕虹 +5 位作者 邢云瑞 胡思宇 孙亚宁 邢广旭 邓瑞广 张改平 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2477-2483,共7页

为制备高亲和力的大豆凝集素(SBA)单克隆抗体,本试验以50μg SBA蛋白/200μL乳化液/只的剂量免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和灵敏性。选择血清效价和灵敏性较好的小鼠进行细胞融合。通过有限稀释亚克隆筛选... 为制备高亲和力的大豆凝集素(SBA)单克隆抗体,本试验以50μg SBA蛋白/200μL乳化液/只的剂量免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和灵敏性。选择血清效价和灵敏性较好的小鼠进行细胞融合。通过有限稀释亚克隆筛选出能稳定分泌SBA单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法批量制备SBA单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,SBA免疫的4只小鼠中,1号小鼠效价最高且灵敏性最好,半数抑制浓度(IC50)为571.4μg·L^-1。选取该小鼠进行细胞融合,并最终得到1株杂交瘤细胞,命名为5B4E10。制备的SBA单克隆抗体的效价达到1∶409600以上,IC50为82.04μg·L^-1,亚型为IgG1型,亲和力常数(Ka)为1.83×10^9 L·mol^-1。且该抗体与大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和其他抗营养因子无交叉反应。本研究结果为建立大豆及其制品中SBA的免疫学检测方法奠定了良好的抗体基础。 展开更多

关键词 大豆凝集素(SBA) 动物免疫 细胞融合 杂交瘤筛选 单克隆抗体

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IPMA筛选猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体方法研究 被引量：3

7

作者 杨艳艳 乔松林 +8 位作者 李睿 郭军庆 李青梅 滕蔓 王丽 赵东 李学伍 邓瑞广 张改平 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2019年第3期217-223,共7页

为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12h后用含3%H2O2的甲醇固定细胞,以... 为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12h后用含3%H2O2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 免疫过氧化物酶单层细胞试验 筛选 单克隆抗体

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草甘膦人工抗原的制备及兔源多抗的ELISA鉴定 被引量：3

8

作者 王晶 王耀 +6 位作者 王方雨 邓瑞广 胡骁飞 余秋颖 郝俊芳 邢云瑞 侯玉泽 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第4期65-69,共5页

采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)法和戊二醛(glutaraldehyde,GA)法,合成了草甘膦(N-(phosphonomethyl)glycine,PMG)人工抗原,通过免疫制备高敏感性、特异性的... 采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)法和戊二醛(glutaraldehyde,GA)法,合成了草甘膦(N-(phosphonomethyl)glycine,PMG)人工抗原,通过免疫制备高敏感性、特异性的兔PMG多克隆抗血清并进行鉴定。将PMG分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)偶联,合成免疫抗原PMG-BSA和包被抗原PMG-OVA。经紫外扫描、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后,免疫新西兰大白兔,制备多抗。利用间接酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定多抗效价,间接竞争ELISA方法测定血清的敏感性和特异性。结果表明,免疫的3只兔血清效价均达1∶104以上,2号兔多抗效果最好,半数抑制浓度(IC50)为30.9μg/m L,且具备良好的特异性。本实验成功合成了PMG人工抗原,并制得了敏感性高、特异性好的兔多抗,为PMG的免疫学快速检测方法的提供参考。 展开更多

关键词 草甘膦 人工抗原 多抗 酶联免疫吸附检测

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高灵敏度磁荧光免疫层析试纸模式构建及在呕吐毒素检测中的应用 被引量：2

9

作者 孙亚宁 杨苏珍 +5 位作者 杨继飞 胡骁飞 陈鑫鑫 张颖硕 邓瑞广 张改平 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第18期310-317,共8页

构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DO... 构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体进行偶联,一步法制备磁荧光抗体探针,以DON人工抗原(DON-BSA)为检测线建立磁荧光免疫层析试纸。同时用胶体金标记DON单克隆抗体,以DON-BSA为检测线建立胶体金免疫层析试纸;制备的磁荧光抗体探针具有很好的磁性、荧光特性及抗体反应性,基于该探针成功制备了DON磁荧光免疫层析试纸,该试纸回归方程为y=-0.562x+0.921,R^(2)=0.990,IC_(50)为5.611 ng/mL,检出限为1.089 ng/mL;制备了DON胶体金免疫层析试纸,该试纸裸眼检测灵敏度为500 ng/mL;定量检测回归方程为y=-0.543x+1.485,R^(2)=0.991,IC_(50)为65.16 ng/mL,检出限为11.94 ng/mL。DON磁荧光免疫层析试纸的灵敏度是胶体金免疫层析试纸的10.96倍。本实验建立的磁荧光免疫层析试纸模式可以同时实现样品的富集及荧光信号检测,提高检测灵敏度,并成功用于DON的检测,为磁荧光纳米颗粒广泛应用于免疫层析领域提供参考。 展开更多

关键词 磁荧光纳米颗粒 免疫学检测 呕吐毒素 试纸

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基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度玉米赤霉醇单克隆抗体 被引量：1

10

作者 胡骁飞 李青梅 +5 位作者 姚静静 胡思宇 孙亚宁 邢云瑞 邓瑞广 张改平 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期1071-1080,共10页

【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇(zearalanol,ZAL)单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN)制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺(EDC)... 【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇(zearalanol,ZAL)单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN)制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺(EDC)法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC50)为577 pg·mL^-1,亲和力常数Ka=6.21×10^7 L·moL^-1,与结构类似物β-玉米赤霉醇(β-zearalanol,β-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZEL)、β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZEL)、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。 展开更多

关键词 玉米赤霉醇 玉米赤霉酮 结构类似物 交叉反应 单克隆抗体

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大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：1

11

作者 王耀 李燕虹 +6 位作者 吴佳蓓 邢云瑞 曹金博 陈秀金 李兆周 邓瑞广 胡骁飞 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第7期216-221,共6页

为制备免疫学特性良好的大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(BBI)单克隆抗体(mAb),以50μg/只的免疫剂量将BBI免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA和间接竞争ELISA试验鉴定多抗血清效价和敏感性。选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,... 为制备免疫学特性良好的大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(BBI)单克隆抗体(mAb),以50μg/只的免疫剂量将BBI免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA和间接竞争ELISA试验鉴定多抗血清效价和敏感性。选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到分泌BBI m Ab的稳定杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备BBI mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明:1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度(IC50)为868.58 ng/mL。经细胞融合筛选得到5株杂交瘤细胞,其中3B7-B10 mAb效价达到1∶4.096×10^5以上,亚型为IgG1型,IC50为83.07 ng/mL,具有亲和力较高且特异性强的优点,表明所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立大豆及其制品中BBI的免疫学检测方法提供良好的抗体基础。 展开更多

关键词 大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子 单克隆抗体 免疫学特性

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动物专用药物氟苯尼考的研究进展 被引量：18

12

作者 张春辉 邢广旭 +5 位作者 胡骁飞 邓瑞广 王方雨 张改平 吕全建 张卫宪 《中兽医医药杂志》 2019年第5期95-98,共4页

从氟苯尼考的构效关系、药物效应动力学及药物动力学等方面进行综述,为更科学地指导临床使用氟苯尼考,延长氟苯尼考的使用期限,保障动物源食品的安全提供参考。

关键词 氟苯尼考 药效学 药代动力学 体内过程 检测方法

原文传递

氟苯尼考琥珀酸钠抗原的制备与鉴定 被引量：1

13

作者 张春辉 邢广旭 +3 位作者 胡骁飞 王方雨 邓瑞广 张改平 《中兽医医药杂志》 2017年第6期17-20,共4页

为获得效价高、特异性好的氟苯尼考的小鼠多抗血清,建立氟苯尼考的免疫学检测方法。选用氟苯尼考琥珀酸钠为靶标,用活化酯法将其分别与牛血清蛋白(albumin from bovine serum,BSA)和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)进行偶联,制备F-S-Na-BSA人... 为获得效价高、特异性好的氟苯尼考的小鼠多抗血清,建立氟苯尼考的免疫学检测方法。选用氟苯尼考琥珀酸钠为靶标,用活化酯法将其分别与牛血清蛋白(albumin from bovine serum,BSA)和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)进行偶联,制备F-S-Na-BSA人工免疫原和F-S-Na-OVA包被原,并用紫外扫描(UV)和SDS-PAGE法鉴定。用50μg/只剂量免疫8周龄的BALB/c小白鼠,制备小鼠多抗血清(pAb),用间接ELISA测定多抗血清(pAb)的效价和特异性。结果:220~350 nm内,F-S-Na-BSA和F-S-Na及BSA的最大吸收峰发生了位移;在SDS-PAGE凝胶电泳中,F-S-Na-BSA的迁移量比BSA略小,与预期的结果相符合。免疫的63只小鼠效价均达到1∶6 400以上;效价最高的1号小鼠IC_(50)≈10μg/m L。结论:F-S-Na-BSA偶联成功,注射小鼠获得了良好的免疫效果,但该多抗血清特异性较差。 展开更多

关键词 氟苯尼考 血清浓度 鸡 人工抗原

原文传递

免疫分析技术在四环素类抗生素残留检测中的应用 被引量：17

14

作者 曹金博 王耀 +4 位作者 胡骁飞 邓瑞广 李燕虹 孟继秋 古绍彬 《饲料工业》 北大核心 2019年第12期53-59,共7页

四环素类抗生素一类广谱性抗生素,主要用于治疗各种感染性疾病,但长期的违规滥用,导致其在动物源性食品以及环境中大量残留,严重威胁人类健康。因此,急需建立简单、灵敏的快速检测方法。免疫分析技术因其特异性强、灵敏度高等优势已成... 四环素类抗生素一类广谱性抗生素,主要用于治疗各种感染性疾病,但长期的违规滥用,导致其在动物源性食品以及环境中大量残留,严重威胁人类健康。因此,急需建立简单、灵敏的快速检测方法。免疫分析技术因其特异性强、灵敏度高等优势已成为快速检测方法研究的热点。本文主要综述了已在四环素类抗生素残留检测中应用的放射性免疫、酶联免疫、胶体金免疫层析以及电化学免疫传感器免疫分析方法,并对其发展方向进行展望。 展开更多

关键词 四环素类抗生素 残留 免疫分析 快速检测

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猪瘟抗体检测试纸研发及制备工艺的优化 被引量：8

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作者 孙亚宁 王丽 +6 位作者 王栋 杨苏珍 陈鑫鑫 刘亚伟 张立林 邓瑞广 张改平 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期169-175,共7页

为研制灵敏、准确、稳定的猪瘟抗体检测试纸,对胶体金标记猪瘟病毒(CSFV)Erns-E2蛋白的pH、封闭液、保存液及样品垫等试纸生产各环节的保护剂、稳定剂及缓冲系统进行优化,确定猪瘟抗体检测试纸生产的工艺参数,使试纸的准确性、灵敏度及... 为研制灵敏、准确、稳定的猪瘟抗体检测试纸,对胶体金标记猪瘟病毒(CSFV)Erns-E2蛋白的pH、封闭液、保存液及样品垫等试纸生产各环节的保护剂、稳定剂及缓冲系统进行优化,确定猪瘟抗体检测试纸生产的工艺参数,使试纸的准确性、灵敏度及稳定性满足批量生产要求。该试纸在室温干燥条件下可稳定保存1a以上,为实现猪瘟抗体检测试纸的商业化及广泛应用奠定基础。 展开更多

关键词 猪瘟 抗体 试纸 优化

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猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用 被引量：4

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作者 周新宇 陈鑫鑫 +4 位作者 乔松林 郭振华 李睿 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2021年第1期142-151,共10页

为鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株,根据类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株非结构蛋白2(Nsp 2)基因序列差异,设计特异性引物和探针,建立TaqMan荧光定量PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果... 为鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株,根据类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株非结构蛋白2(Nsp 2)基因序列差异,设计特异性引物和探针,建立TaqMan荧光定量PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,2种方法中,标准品在10^(3)~10^(8)拷贝/μL均具有良好线性关系,标准曲线R^(2)值均在0.990以上;基于TaqMan探针法的荧光定量PCR方法,JXA1-R株、HNhx株的最低检出量分别为10^(4)、10^(3)拷贝/μL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的最低检出量均为100拷贝/μL;重复性分析结果显示,批内和批间试验的变异系数均小于1.5%,呈现出良好重复性。综上,成功建立了鉴别检测类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株的方法,且稳定性好、特异性强,可以为PRRSV的鉴别检测提供技术支持。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 JXA1-R疫苗株 HNhx毒株 TaqMan荧光定量PCR SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 鉴别检测

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禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定 被引量：4

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作者 赵翔玥 张二芹 +9 位作者 许倩茹 马凡舒 王雅楠 牛香香 李雪洋 张申立 张同旭 邓瑞广 张以芳 张改平 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2020年第4期230-238,共9页

为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载... 为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H9N2 HA蛋白 纯合子 水稻胚乳 活性鉴定

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CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定 被引量：3

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作者 王勋 张雨杭 +6 位作者 孙亚宁 李青梅 李鸽 王丽 郭军庆 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2021年第4期147-153,共7页

为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结... 为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas13a蛋白 原核表达 镍柱亲和层析 连带剪切酶活性 核酸检测

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H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立 被引量：4

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作者 石建州 李青梅 +5 位作者 王彦红 刘肖 李鸽 郭军庆 邓瑞广 张改平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期2691-2698,共8页

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个... 本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10 2.63 TCID 50/100μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰H 2O 2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1∶3 200的HI=2-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。 展开更多

关键词 H1N1亚型猪流感病毒 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA) 单克隆抗体

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甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究 被引量：2

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作者 赵慧君 赵旭阳 +7 位作者 史西保 陈静 范小敏 王丽 李青梅 常晓博 邓瑞广 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期903-911,917,共10页

为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36... 为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pcDNA3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-MBD2,用pcDNA3.1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRT-PCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 甲基-CpG结合结构域蛋白2 miR-373

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